FIAT REPORT NO. 1100 ADVANCES IN THE BYOCHEMISTRY OF THE CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIA GROUP WITH SPECIAL REFERENCE TO THE PATHOLOGICAL PHYSIOLOGY OF DIPHTERIA IN MAN OFFICE OF MILITARY GOVERNMENT FOR GERMANY (US) jpMJDkJNEORMATION AGENCY, TECHNICAL (US) OFFICE OF MILITARY GOVERNMENT FOR GERMANY (US) FIAT REPORT NO. 1100 26 JUNE 1947 ADVANCES IN THE BYOCHEMISTRY OF THE CORYNEBACTER1UM DIPHTHERIA GROUP WITH SPECIAL REFERENCE TO THE PATHOLOG1CAL PHYSIOLOGY OF DIPHTERIA IN MAN BY GEORG TARNOWSKI BAD KOHLGRUB / Oberbayern THIS MANUSCRIPT WAS RECEIVED AND REGISTERED ON 4 OCTOBER 1946 BY SCIENTIFIC BRANCH, FIELD INFORMATION AGENCY, TECHNICAL (US) ABSTRACT. A review is presented of the problem of Chemical composition of diphtheria baciili, their metabolism, their toxin-production, and the action of this toxin on the organism, with reference to the published work of the last 20 years in this field, as well as to the original work of the author. The reference material is critically discussed, based on the original work and experiences of the author. BIOGRAPHICAL NOTE. Dr. Georg Tarnowski, during his study of medicine, carried out some unpublished experimental studies on the catalase and on the endogenous uric acid in man. He graduated as M. D. at the University of Beigrade in 1935. He worked as practicing physician and later as bacteriologist in several Institutes in Jugoslavia until 1942. From 1942 to 1944 he was employed as bacteriologist at the Institute of Hygiene, University of Berlin (Director; Prof. K. W. Clauberg). During this time, four experi- mental studies on the fermentation activities of diphtheria baciili (three of them published) and two Statistical papers on the effectiveness of diphtheria and scarlet fever vaccination were written. At the same time the material for the present mono- graph was gathered and prepared for publication. Fortschritte der Biochemie der Corynediphtherie-Gruppen unter besonderer Berücksichtigung der pathologischen Physiologie der menschlichen Diphtherie von Georg Tarnowski. I. Einleitung. Die Erkenntnisse auf dem Gebiet der Physiologie und Biochemie der Diphtherie- bakterien wurden, wie übrigens auch bei anderen pathogenen Mikroorganismen, zum größten Teil bei der Verfolgung von drei theoretisch und praktisch bedeutsamen Problemen gewonnen. Man erstrebte einerseits die Auffindung solcher Merkmale der in Frage kommenden Keime, die ihre schnelle und sichere Abgrenzung von den ver- wandten Formen der Flora des Menschen und der Tiere ermöglichen sollen. Im Falle der Diphtheriebakterien sind es verschiedene Vertreter der Gattung Corynebacterium, die auf den menschlichen Schleimhäuten und Wundfiächen vegetieren, ohne dabei an ihnen und im ganzen Organismus pathologische Veränderungen hervorzurufen. Beim Studium dieses ersten — diagnostischen — Problems wurden viele Auskünfte über die Baustoffe, Fermente und Antigene der Diphtheriebakterien und anderer Corynebakterien gesammelt. Die Notwendigkeit der Züchtung dieser Bakterien in künstlichen Nährsubstraten führte zur eingehenden Beschäftigung mit ihren Nähr- stoffbedürfnissen und Wuchsstoffen. Von besonderer Wichtigkeit erwiesen sich dabei die Fragen der energieliefernden Vorgänge, die die Grundlage des Stoffwechsels jeder lebenden Zelle bilden und die zum Teil auch diagnostisch verwertet werden können (z. B. Teiluritreduktion). Zu solchen fundamentalen physiologischen Leistungen der Bakterien gehört auch ihre Fähigkeit, verschiedene Kohlehydrate zu vergären. Auf Grund der festgestellten fermentativen Unterschiede wurden zuverlässige Differen- zierungsmethoden ausgearbeitet. Andererseits brachte die Erforschung des wasserlöslichen Diphtherietoxins uns dem Verständnis der biologischen und chemischen Eigenschaften dieses pathogenetisch wichtigen Wirkstoffs viel näher. Die erfolgreichen Versuche der Reinigung des Toxins von verschiedenen Ballaststoffen des Züchtungsmediums und der zerfallenen Bak- terienzellen führten zur Erhaltung eines fast chemisch reinen Diphtherietoxins, das nunmehr mit Hilfe der Methoden der modernen Proteinchemie untersucht werden könnte. Die Tatsache, daß die toxischen und antigenen Partialfunktionen des Toxin- moleküls zu einem gewissen Grade voneinander unabhängig sind, ermöglichte die Ent- giftung des nativen Toxins unter gleichzeitiger Aufrechterhaltung seiner immunisa- torischen Qualitäten. Das Ergebnis dieser Entwicklung war die Herstellung von höchst- wirksamen und fast reaktionslosen Diphtherie-Schutzstoffen. Auch hierbei wurden zahlreiche Kenntnisse über die chemische Natur des Toxinteilchens, das zweifellos zur Gruppe der Proteine mit einem ziemlich hohen Teilchengewicht gehört, gesammelt. Endlich beim Studium des dritten Fragenkreises — der kausalen Genese der Stö- rungen im Stoffwechsel und Funktionen einzelner Organe und ihrer Systeme, die bei der diphtherischen Intoxikation von Menschen und Tieren auftreten, — näherte man sich dem schwierigsten und interessantesten Knotenpunkt der gesamten Diphtherie- forschung. Im Laufe dieser Untersuchungen, die anfänglich noch vollkommen durch die Methodik und Begriffe der klassischen pathologischen Anatomie und Histophysiologie 5 beherrscht wurden, drang man mit der Zeit immer mehr zur Erschließung der bio- chemischen Probleme, insbesondere aber in das Gebiet der submikroskopischen Mor- phologie der Zellbestandteile und der interzellularen Substanzen. Die Fragen der Kapillarenpermeabilität, der Wirkung des in den Körpersäften gelösten Toxins auf Myokard, Nervengewebe, Nebennieren und andere endokrine Organe erhielten eine neue Beleuchtung. Störungen im Stoffwechsel von Elektrolyten, N-Körper, Kohle- hydrate, Schwermetalle, Vitamine, körpereigener Wirkstoffe (Adrenalin, Glutathion, Ascorbinsäure, Corticosteron) wurden am Krankenbett und im Tierexperiment studiert. Aber hinter allen diesen Teilfragen steht auch heute noch das ungelöste Problem der Hierarchie und Korrelation aller dieser Störungen. Auf welche Substrate und in wel- chen Geweben greift das im Blut kreisende Diphtherietoxin zuerst an? Von welcher Art ist dieser Angriff? Kann er auf irgendwelche jetzt bekannten fermentativen oder anderen Mechanismen zurückgeführt werden? Welche Rolle kommt dabei den ein- zelnen, bisher andeutungsweise erkannten Wirkgruppen des Toxinteilchens (Amino-, Guanidino-, Tyrosino-Gruppen) zu? Wie sind diese Prozesse miteinander verknüpft und in welcher Reihenfolge? Ein ziemlich reiches Tatsachenmaterial hegt für die Beant- wortung einiger dieser Fragen vor. Wir versuchten in unserem Bericht dieses Material zusammenzutragen, um die zu- künftige theoretische und experimentelle Forschung auf diesem Gebiet der Menschen- pathologie zu erleichtern. Wir ließen dabei bewußt das enorme Gebiet der immun- biologischen Fragestellungen bei Diphtherie, mit wenigen Ausnahmen, praktisch unbe- rührt. Es gibt doch in der Weltliteratur mehrere umfangreiche und moderne Darstel- lungen dieser Fragen von berufensten Fachleuten. Deshalb beschränkten wir uns auf die Erörterung von Problemen der Biologie und Biochemie der Diphtheriebakterien und verwandter Corynebakterien sowie der pathologischen Physiologie oder vielmehr der Pharmakodynamik der diphterischen Intoxikation bei Menschen und Tieren. 6 II. Baustoffe und Wirkstoffe. 1. Allgemeines und N-haltige Körper. Die chemische Zusammensetzung der Bakterienleiber der Diphtheriebakterien ist bisher nur von wenigen Autoren bearbeitet. Die gewonnenen Ergebnisse sind noch sehr fragmentarisch und können nur ein unvollkommenes Bild über die Beteiligung einzelner chemischer Körper an dem Aufbau der Di-Bakterienzellen geben. Noch 1892 haben S. v. Dzierskowki und Rekowski (1) in trockenen Di-Bakterien das Vorhandensein von: Ätherlöslichen Substanzen 1,62 °/o Kohlehydraten 28,00 °/o Asche 4,57 °/o festgestellt. Den N-Gehalt bestimmten sie zu 11,20%, den C-Gehalt zu 48,90%. M. Nikolle und E. Alilaire (3) fanden, daß die Diphtheriebakterien bis 84,50 % Wasser, ihre getrock- neten Leiber bis 69,70 % Protein enthalten. S. Tamura (5, 6) hydrolisierte die getrockneten Diphtheriebakterien mit 66 % H2SO4 und gewann nach einer Verdünnung des Hydrolysats mit Wasser (bis zum Ge- halt von 5 % H2S04) eine unlösliche und eine lösliche Fraktion. Aus der Lösung konnte er die 1-Arabinose als Benzylphenylhydrazon isolieren. Im unlöslichen eiweißartigen Teil wurden nach weiterer Säurehydrolyse folgende Amino- säuren gefunden: Valin, Leuzin, Isoleuzin, Tyrosin, Prolin, Lysin, Histidin und Arginin. In der neueren Zeit hat J. Hirsch (2) mit größeren Mengen (2—3 gr. Bakterien- trockenmasse pro Versuch) sorgfältig mit Kochsalzlösung gewaschenen und getrock- neten Diphtheriebakterien folgende interessante Werte erhalten: N—ca. 10,95 % P— 0,654—0,959 % Lipoide — 3,18—3,99 % — (braunrotes toluollösliches Fett). Aus den getrockneten Bakterien konnte er bei Extraktion mit Wasser bzw. Koch- salzlösung bis ca. 20 % des Gesamt-N in die Lösung bringen. Bemerkenswert ist dabei, daß aus frischen und feuchten Bakterien keine nennenswerten N-Mengen extrahiert werden könnten. Weiterhin wurden nach vollständiger Hydrolyse der Bakterienzellen mit HCl die verschiedenen N-Fraktionen nach der Methode von van Slyke bestimmt. Wir zitieren die gewonnenen Resultate auf Grund der Tabelle 2 der genannten Arbeit von Hirsch (1. c., S. 666): 7 TABELLE I Fraktionen J, Hirsch S. Tamura NH3-N 11,55 — 13,05 % Humin-N 1,01— 2,29 % 24,75 % Hexonbasen-N 32,24 — 35,00 % 16,89 % Hexonbasen-NHo-N 16,65 —17,14 % — Arginin-N 15,45 — 17,16 % 10,46 % Histidin-N 5,32— 7,46% 1,03 % Zystin-N 1,26— 2,10% — Lysin-N 9,09 — 10,10% 4,93 % N des Filtrats nach der Hexon- basenfällung 53,04 — 55,39 % 54,62 % Sein Amino-N 44,80 — 47,41 % — Sein Nicht-Amino-N 8,30— 7,97% — N in unbekannter Form — 3,76 % Man ersieht aus dieser Zusammenstellung, daß die Diphtheriebakterienproteine fast bis zu Vs aus basischen Aminosäuren bestehen. Besonders fällt der Reichtum an Ar- ginin auf, der fast Ve des Gesamt-Protein-N darstellt. Nachdem wir aus neueren Ar- beiten hauptsächlich von Eaton und Pappenheimer einen Hinweis auf die große Rolle der Aminofunktionen, besonders aber der guandinartigen Strukturen, bei dem Zu- standekommen der Toxizität des Diphtheriegifts erhalten haben, erscheint uns dieser ausgesprochene Argininreichtum der Diphtheriebakterienproteine sehr bedeutsam. NB. Bei S. Tamura fällt ein sehr starker Humin-N-Gehalt auf, der wahrscheinlich auf eine zu energische Säurebehandlung der Bakterienzellen zurückzuführen ist. Soehring (4) hat (in Anlehnung an ein von ihm für den Fall von Colibakterien aus- gearbeitetes Verfahren) die einem serumhaltigen Nährmedium gezüchteten Diphtherie- bakterien mit Kochsalzlösung gewaschen und die gewaschenen Bakterienleiber im Vakuum getrocknet. Nach der Extraktion der trockenen Bakterienmasse mit Wasser bekam er eine alkalische Proteinlösung, die 0.05—0.2 °/o Eiweiß mit 12.5 °/o N enthielt. Keine reduzierenden Zucker konnten im erhaltenen Präparat, auch nach der erfolgten HCl-Hydrolyse, nachgewiesen werden. Nach der Reinigung des Präparats durch Elektrodialyse erhielt man das Bakterienprotein in kleinen gelben bis braunen Plättchen; 0.1—1.0 ccm einer 0.1 °/oigen Aufschwemmung rief bei Meerschweinchen keine lokale oder allgemeine Toxinreaktion hervor. Das Protein wird für das reine Diphtheriebakterien-Eiweiß gehalten. ?. Lipoide. Nach den ersten älteren Arbeiten von H. Aronson (7) und S. Tamura (loc. cit.) wurde die Frage der Lipoide der Diphtheriebakterien längere Zeit in der Literatur nicht behandelt. Erst 1930 untersuchte H. von Behring (8) die auf sterinfreiem Peptonagar gezüch- teten Diphtheriekulturen und fand dabei, daß sie keine Spuren von Sterinen enthalten. 8 E. Chargaff (11, 12) isolierte aus größeren Mengen (fast 300 gr) getrockneter Diph- theriebakterien eine Reihe von Lipoiden und gab ihre Verteilung (verglichen mit der der Menschentuberkelbakterien) folgendermaßen an; Diphtherie- bakterien Tuberkel- bakterien Azetonlösliches Fett 3,97 °/o 6,20 % Azetonschwerlösliches Fett 0,25 °/o — Azetonunlösliche Phosphatide 0,41 % 6,54 °/o Wachs 0,27 °/o 11,03 °/o Summe 4,90 °/o 23,77 % Polysaccharid 0,08 % 0,87 °/o Übrige Substanzen des Bakterientrockenrückstandes 95,00 °/o 75,01 % Das Fett, von dem 25 gr zur Analyse Vorlagen, enthält kein Glyzerin; es ist kein echtes Glyzerid. Wie auch im Falle der Tuberkelbakterien wird die Hauptmenge des Fetts aus den esterartigen Verbindungen von Fettsäuren mit Polysacchariden gebil- det. Außerdem enthielt es eine große Menge freier Fettsäuren, die in den Bakterien- leibern vorliegen, nicht aber erst bei ihrer Aufarbeitung durch Hydrolyse entstehen. Die Natur des mit den Fettsäuren veresterten Körpers (Polysaccharid?) blieb ungeklärt. An Fettsäuren wurden gefunden: a) Palmitinsäure — etwa Vs der gesamten Fett- säuren; b) Palmitolein- oder Zoomarinsäure [Hexadecen- (9) säure], CH:} . (CH2)5 . CH = CH . (CH2)7 . COOH, die dadurch bemerkenswert ist, daß sie sonst nur in einigen Fischfetten und Tranen, in Pflanzen aber überhaupt nicht vorkommt; c) eine unge- sättigte Säure von einer Bruttoformel CuHssOs; d) ein Gemisch aus hochmolekularen ungesättigten Säuren. Darunter steht gewichtsmäßig an erster Stelle die sog. Diphtheriensäure mit einem Molekulargewicht = 520, einer Bruttoformel von etwa 20° CssHfisOs, Schmelztemperatur = 35—36°, Siedepunkt = 260 °, [a] = —2,6° und einer Doppelbindung. Diese eigenartige Säure enthält ebenso wie die anderen ungesättigten Fettsäuren der Diphtheriebakertien keine normale C-Kette. Das Phosphatid, von dem nur 1 gr untersucht wurde, zerfiel bei Hydrolyse mit ver- dünnten Säuren in Aldohexosen, Fettsäuren (vorwiegend Palmitinsäure und höher ungesättigte flüchtige Säuren) und in eine hochmolekulare, in heißem Alkohol und Äther schwer lösliche Substanz — Corynin (C50H100O4?). Sie hat einen Schmelzpunkt = 70—71 °, einen Siedepunkt von ca. 220 °. Corynin ist von aaurem Charakter, hat eine Carboxyl- und zwei Hydroxylgruppen, besitzt drei aktive H-Atome und läßt sich azetylieren. Das Unverseifbare enthält, wie früher schon hervorgehoben, keine Sterine, ist intensiv rotbraun gefärbt, liefert aber bei einer chromatographischen Analyse keine deutlichen farbigen Adsorptionsbänder. H. Cassagne (10) fand, daß der Gehalt an azetonlöslichen Lipoiden mit dem Alter der Diphtheriekulturen zunimmt. Während er in einer nur vier Tage alten Kultur 4,82 % des Bakterientrockengewichts ausmachte, stieg er am 14. Tage bis zu 7,90 °/o an. In ihren Untersuchungen extrahierten M. Macheboeuf und H. Cassagne (17) die Diphtheriebakterien mit verschiedenen Lösungsmitteln (Wasser, Methanol, Äthanol, Äther). Einige Fraktionen, besonders die methylalkoholischen, erwiesen sich dabei als 9 phosphorreich. Sie hatten auch die stärkste Affinität zum Tuberkulosenserum, rea - gierten aber nicht mit dem Serum von Kaninchen, die mit Diphtheriebakterien im- munisiert waren. Der wasserlösliche Anteil der Methanolfraktionen enthielt viel Na-Palmitat (die trockenen Bakterien enthalten bis 0,6 °/o Palmitinsäure). Die anderen Bestandteile dieser Fraktion sind im angesäuerten Äther leicht löslich. Mandelbaum (18) hat gefunden, daß die echten Diphtheriebakterien auf Löffler- serumplatten gezüchtet, die aus einem an gelbem Farbstoff (Karotine oder Flavine) besonders reichen Serum von Weidekühen hergestellt wurden, in ihren Kolonien den betreffenden Farbstoff aufstapeln können. Die Kolonien fielen durch ihre gelbe Farbe auf und ließen sich dadurch von weiß bleibenden Kolonien der Pseudodiphtherie- bakterien makroskopisch unterscheiden. Die Bakterienleiber von einigen Stämmen der gelbwachsenden Diphtheriebakterien zeigten in manchen Fällen das Auftreten von eigenartigen lichtbrechenden Gebilden, die der Verfasser als Myelingebilde be- trachtete. Außerdem betonte er das Vorhandensein von Cholesterinkristallen in sol- chen Kolonien. Mandelbau versuchte diese myelinreichen Stämme ätiologisch mit Scharlachfällen zu verbinden und sie als Scharlacherreger zu bezeichnen. Trotz einer eingehenden Diskussion, die unmittelbar nach dieser am 12. XII. 1927 in einer Sitzung der Berliner mikrobiologischen Gesellschaft gemachten Mitteilung stattfand, wurden diese Be- obachtungen nicht weiter verfolgt und gerieten in Vergessenheit. Die Frage der serologischen Bedeutung einiger Lipoidfraktionen der Diphtherie- bakterien sowie Diphtherietoxinlösungen haben zuerst A. Boquet und L. Negre (9) bearbeitet, die über eine weitgehende Verwandtschaft zwischen den Diphtherie- und Tuberkelbakterienlipoiden berichteten. J. Freund (13) extrahierte die gewaschenen und getrockneten Diphtheriebakterien erst mit Aceton, dann mit Alkohol. Die erhal- tenen Extrakte ergaben eine Komplementbindung nur mit antibakteriellen Diphtherie- sera. Antitoxische Diphtherie-, Tuberkulose- sowie Streptothrix-Immunsera erwiesen sich als wirkungslos. Das Diphtherieantigen entfernte aus einem Diphtherieserum nicht nur die homologen Antikörper, sondern auch solche die gegen intakte Diphtherie- bakterienkörper gerichtet sind. Das Komplementbindungstiter ging bis 1 : 160, wenn die Diphtherie-Immunsera mit Diphtherie-Bakteriensuspensionen oder mit einem Alkoholextrakt versetzt wur- den; Titer bis 1 : 10 — 1 : 30 mit Tuberkulose-Bakteriensuspensionen oder Alkohol- extrakten; gar keine Komplementbindung wurde bei Verwendung von Streptothrix- Suspensionen oder Extrakte sowie des Diphtherietoxins beobachtet. E. Kräh und E. Witebsky (15, 16, 20) konnten nach aktiver Immunisierung von Kaninchen mit ab- getöteten Diphtherie-, Pseudodiphtherie- und Tuberkelbakterien die Anwesenheit von sog. „Lipoidantikörpern“ in den erhaltenen Immunseren nachweisen, die mit den alkoholischen Extrakten aus Bakterienzellen aller drei Bakterienarten Komplement- bindung ergaben. Dabei hat sich herausgestellt, daß die erhaltenen Lipoidantikörper in erster Linie eine allen drei Bakterien arten gemeinsame Quote enthalten, außerdem aber noch eine spezifische gegen Diphtheriebakterien gerichtete Komponente, nicht aber eine gegen Pseudodiphtherie-, noch eine gegen Tuberkelbakterienlipoide. Ein ähnliches Verhalten wurde auch in den Diphtherie-Rekonvalenszentenseren, sowie in den therapeutischen Heilseren beobachtet. Auch aus dem Diphtherietoxin er- hielt man durch Alkoholextraktion Auszüge, die mit Diphtherieheilserum spezifische Komplementbindung ergaben. Dabei verhielten sich die einzelnen Toxinproben unter- schiedlich, was wahrscheinlich auf ihren verschiedenen Gehalt an Zellipoiden und anderen Zelleibsubstanzen beruht. Diese alkoholischen Extrakte aus dem Diphtherietoxin erwiesen sich bei der ak- tiven Immunisierung von Kaninchen als vollantigen; das steht im Gegensatz zu dem 10 Verhalten der alkoholischen Organextrakte, die bekanntlich gewöhnlich nur als Hap- tene, nicht aber als Vollantigene wirken können. Die mit diesen Extrakten erhaltenen Immunsera reagierten außer mit den zu ihrer Herstellung verwendeten Diphtherie- toxinen auch noch mit den Diphtheriebakterien selbst, nicht aber aber mit Tuberkel- bakterien. E. Nußbaum (19) erweiterte diese Ergebnisse auch auf die mit Alkohol, Äther, so- wie auch mit Toluol hergestellten Extrakte aus Diphtheriebakterien in der Absicht, dadurch ein biologisches Differenzierungsverfahren für einzelne von E. Chargaff iso- lierte Lipoidfraktionen der Diphtherietaakterien zu schaffen. Er fand, daß alle diese Extrakte mit den antitoxischen Diphtheriesera Komplementbindung ergeben. Solche Antikörper traten auch im Serum der Tiere auf, die mit Vollbakterien bzw. mit Al- kohol oder Toluol „entfetteten“ Diphtheriebakterien immunisiert worden sind. Die beobachteten Komplementbindungsreaktionen waren bei der Verwendung von Al- kohol und Alkohol + Äther-Extrakten wesentlich stärker als mit Toluolextrakten. „Die Deutung der Befunde hinsichtlich des chemischen Charakters der wirksamen Antigene sowie hinsichtlich der unbedingten Spezifität der Reaktion ist — auf Grund des vorliegenden Materials — keineswegs möglich.“ (E. Nußbaum, loc. cit. 320.) Es wur- den Phenomena beobachtet, die die Möglichkeit der Beteiligung der Eiweißantigene, sowie unspezifischer kolloidaler Vorgänge offen lassen. In neuester Zeit revidierte L. Hoyle (14) dieses ganze Problem im Lichte neuer Typenlehre. Es gelang ihm, in den Antiseren von Kaninchen, die mit C. diphtheriae Typ Gravis, Mitis und Intermedius, sowie C. hoffmannii immunisiert waren, durch Kreuzabsorptionsversuche mit alkoholischen Extrakten von diesen Keimen drei ver- schiedene Lipoidantikörper nachzuweisen. Das spezifische h-Antigen kommt nur in C. hoffmannii, das spezifische d-Antigen im Mitistyp und wahrscheinlich in geringen Mengen in den Gravis- und Intermedius-Typen vor, das Gruppenantigen G aber in großen Mengen im Typ Gravis, Intermedius und C. hoffmanni, im Mitistyp nur in geringeren Mengen vor. Das G-Antigen besteht wahrscheinlich aus mehreren Kom- ponenten. Im Serum der Mitis-Rekonvaleszenten wurden nur d-, in dem von Gravis- und Intermediuskranken gewöhnlich nur G-Antikörper gefunden. з. Polysaccharide. Die Bedeutung der verschiedenen pathogenen und saprophytischen Bakterien- arten enthaltenen Polysaccharide und ihrer Verbindungen mit Lipoiden und Poly- peptiden bzw. Proteinen als Vollantigene oder Haptener wurde im Laufe der letzten zwei Jahrzehnte an zahlreichen Mikroorganismen von verschiedenen Forschern ein- gehend untersucht. Der Name der Schulen von Avery, Heidelberger, Goebel, Kendall и. a. ist mit der Erforschung der Pneumokokkenkapsel — und zelleibpolysaccharide, eng verknüpft. Boivin und Mitarbeiter, Morgan und Mitarbeiter, Raistrick und Topley, sowie andere Forscher untersuchten die „glyko-lipoiden“ Vollantigene, die sie aus den ver- schiedenen Vertretern der Typhus-Paratyphus-Enteritis-, Coli- und Ruhrbakterien- Gruppe isolierten und nach gründlichen chemischen und immunologischem Studium einerseits mit ihren Endotoxinen, andererseits mit den O- und Vi-Antigenen identifi- zieren konnten. Linton und Mitarbeiter haben eine ähnliche Untersuchung für die Choleravibrionen durchgeführt. Eine allerdings schon etwas veraltete Darstellung dieses gesamten Forschungsgebietes bringt E. Mikulaszek (20). Bis zu jener Zeit war über die Polysaccharide der Diphtheriebakterien keine Arbeit erschienen. Auch nach- her hat nur eine einzige Gruppe der chinesischen Forscher dieses Problem behandelt. S. C. Wang und T. Tung (24) isolierten aus Diphtheriekulturen der Typen Gravis, Intermedius und Mitis ein Polysaccharid in einem ähnlichen Verfahren, wie es für die 11 Isolierung des Polysaccharids aus B. rhinoscleromatis angegeben ist. Dieses Polysac- charid gab eine positive Molisch-Reaktion noch in schwacher Lösung und wurde vom typ-homologen ebenso wie von den heterologen Antiseren präzipitiert. Das Polysac- charid absorbierte jedes der Typ-Antisera komplett. Aber auch das Polysaccharid der avirulenten Diphtheriekulturen konnte sämtliche Typsera absorbieren; ein mit einer a virulenten Kultur hergestelltes Antiserum präzipitierte dagegen die Diphtherie- Polysaccharide nicht. In weiteren Untersuchungen gelang es den Verfassern (25) die fünf von ihnen untersuchten Diphtheriestämme in zwei serologisch verschiedene Gruppen aufzuteilen. Das Polysaccharid der Gruppe A (3 — Mitis und 1 — Intermedius) wurde für alle vier Stämme als serologisch identisch, aber vom Polysaccharid B, des einzigen untersuchten Gravisstammes, als verschieden gefunden. Die Polysaccharide aus den Stämmen von C. xerosis (Wang und Tung (26)) erwiesen sich im Präzipitationsversuch serologisch als mit den Diphtheriepolysacchariden iden- tisch, was als Stütze für die Auffassung von C. xerosis als „degenerierten Abkömm- lingen der Diphtheriebakterien“ benutzt wurde. Die Polysaccharide aus C. hoffmannii wurden aber von denen der Diphtheriebakterien als serologisch völlig verschieden gefunden. Bei weiterer Vervollkommnung der Darstellung der Diphtheriezellantigene kamen die chinesischen Verfasser zum abgeänderten Verfahren (Wang und Tung (27, 28). Die eine Woche alten Kulturen vom Hottinger-Nährboden wurden abzentrifugiert, ab- wechselnd mit destilliertem Wasser und 95 % Alkohol gewaschen und dann mit einer Äther-Alkohol (ää)-Mischung zu einer dicken Suspension der Keime zubereitet. Nach fünftägigem Aufenthalt bei 37 °, bei häufigem Umschütteln, wurde die Suspension durch gewöhnliches Filterpapier filtriert. Aus dem Filtrat wurde durch Verdampfung und Reinigung mit Petroläther die Lipoidfraktion gewonnen. Aus dem gelben Filter- rückstand, der in 95 % Alkohol schlecht, in Äther und anderen Fettlösungsmitteln leicht löslich war, gewann man durch weitere Behandlung eine Protein — eine Kohle- hydrat — und eine andere Lipoidfraktion. Lipoide und Kohlehydrate (29) erwiesen sich als gruppen-, das alkalilösliche Protein als typenspeziflsch. Seine Typenspezifität ist thermolabil; das Protein geht beim Er- hitzen auf 56 0 innerhalb 30 Minuten in ein nur gruppenspezifisches Protein über. Weitere chemische und immunologische Studien über diese verschiedenen Zell- antigene der Diphtheriebakterien, sowie die Nachprüfung der Befunde von Wang und Tung bleiben zur Zeit aus. Erwähnenswert ist noch der Befund von F. Ottensooser (23), wonach in den meisten Diphtherietoxinen (und Toxoiden) eine größere Menge des A-Isohämagglutinogens (des Trägers des Blutkörperchenmerkmals A) gefunden wurde. Diese Substanz ist be- kanntlich ein glukosaminhaltiges Polysaccharid. Sie ist aber kein Produkt des Bak- terienstoffwechsels und gelangt in die Toxinlösungen mit dem Pepton, welches sehr reich an diesem Polysaccharid sein kann (besonders das Schweinemagenpepton). Nach den Befunden des Verfassers steht der Gehalt des Formoltoxoids an diesem Körper in keinem Zusammenhang mit der Stärke der Nebenreaktionen bei Verwendung des Toxoids zu Schutzimpfzwecken. Zusammenfassend kann man den heutigen Stand unserer Kenntnisse über die Diphtheriebakterienantigene wie folgt formulieren: Die Diphtheriebakterien besitzen gruppenspezifische Polysaccharide, typenspezifische alkalilösliche Proteine und gruppen- sowie typenspezifische Lipoide. Es bestehen ge- wisse Überscheidungen zwischen den Diphtherie- und Pseudodiphtheriepolysacchari- den, sowie zwischen den Diphtherie-, Pseudodiphtherie- und Tuberkelbakterienlipoiden. 12 3a. Serologische Beziehungen der Corynebakterien. Die beschriebenen Bestandteile der Zellen von Corynebakterien können als das- jenige chemische Substrat betrachtet werden, das den serologischen Reaktionen dieser Gruppe zugrundeliegt. Die Erforschung der Serologie der Corynebakterien war der Gegenstand vieler eingehender Untersuchungen. An dieser Stelle darf nur eine kurze Übersicht der bisher gewonnenen Ergebnisse gegeben werden. I. Agglutination. Die ältere Literatur über dieses Thema (bis 1916) ist in der Arbeit von Langer (48) enthalten, auf die wir in diesem Zusammenhang verweisen. Die erzielten Resultate waren ziemlich widerspruchsvoll. Die Herstellung von homogenen Diphtheriebak- terien-Suspensionen ist nicht leicht und zwingt zur Anwendung verschiedener Kunst- griffe (Erhitzung der Suspensionen in NaCl-Lösung bei 50—60 °, Glyzerinzusatz, Schütteln, Verwendung besonderer Nährböden). v. Riemsdijk (235) konnte mit Hilfe des polyvalenten Kaninchenserums (aus vier Diphtheriestämmen hergestellt) die Diphtheriebakterien agglutinatorisch scharf von den geprüften Pseudodiphtheriestämmen abtrennen. Die Agglutination der Diphtherie- bakterien verläuft langsamer als z. B. bei Typhus; auch tritt sie erst in kleineren Serumverdünnungen (1/25—1/50) ein. Durand (35) untersuchte 103 Diphtheriestämme mit Hilfe von je vier Kaninchen - bzw. Pferde-Immunsera. Von sieben Stämmen konnte er keine stabilen Suspensionen erhalten, 26 erwiesen sich als von keinem der verwendeten Sera agglutinierbar. Die 70 übrigen Stämme wurden nach ihrer Agglutination mit Pferdesera in vier Sero- typen gruppiert: A (6 St.), B (23 St.), C (17 St.) und D (24 St.). 22 Stämme der D-Gruppe wurden auch von den C-Kaninchensera mitagglutiniert, nicht aber von den C-Pferde- sera. Die C-Kaninchenagglutinine konnten aber nicht durch die D-Stämme erschöp- fend absorbiert werden. Von 54 mitgeprüften Pseudodiphtheriebakterien-Stämmen erwiesen sich 45 als von keinem Diphtherieserum agglutinierbar, neun ergaben keine stabile Suspension. In einer weiteren Arbeit (36) dehnte Durand seine serologische Analyse mit ähn- lichen Ergebnissen auf noch 255 Stämme aus. Hävens (41) gruppierte die von ihm geprüften virulenten Diphtheriestämme in zwei agglutinatorische Serotypen, die morphologisch nicht unterscheidbar waren. Auch die Toxine beider Typen waren nicht scharf voneinander zu differenzieren und be- saßen gemeinsame Rezeptoren. Auch Paxson und Redwitz (58) kamen zu zwei Sero- typen mit serologisch identischen Toxinen. Bell (31) agglutinierte 130 Diphtheriestämme mit dem Park-Williams No. 8-Serum (Kaninchen). Mit einigen, von diesem Serum nicht agglutinierten Stämmen, hat er die stamm-spezifischen Sera hergestellt. Mit Hilfe von drei solcher Sera hat er 80 °/o aller Stämme in drei agglutinatorische Serotypen unterteilt (I—13°/o, II—6°/o und III—61%). Die saccharosespaltenden Diphtheroide wurden von keinem dieser Sera agglutiniert. Auch hier waren die Toxine aller geprüften Stämme serologisch identisch. Hartley (40) konnte die letzte Beobachtung an 12 weiteren Stämmen bestätigen, deren Toxine bis auf etwas verschiedenen Toxoidgehalt sich als identisch erwiesen haben. Smith (67) stellte mit Hilfe der Kaninchen-Immunsera (Titer = 1 ; 12.800) sieben agglutinatorische Serotypen bei 80 Diphtheriestämmen auf; einer davon umfaßte 68 Stämme, während einige nur je einen Stamm enthielten. Es wurden einige Kreuz- reaktionen beobachtet, dabei aber keine Korrelation zur Morphologie oder Virulenz der Keime nachgewiesen. Eagleton und Baxter (37) benutzten die in 5 % Glyzerin- NaCl-Lösung während Va Stunde bei 60 ° erhitzten und dadurch homogenisierten Diphtheriesuspensionen und konnten dabei 323 geprüfter Diphtheriestämme mit Hilfe von Kaninchensera in zehn Serotypen einteilen. Der größte Typ enthielt 145, der 13 kleinste sieben Stämme. Auch hier wurden Kreuzreaktionen nachgewiesen. Poweli (60) hat festgestellt, daß die Agglutinationseigenschaften von ca. 300 Diphtheriestämmen, die in reinen Linien, ausgehend von den Einzelkulturen gezüchtet wurden, während der ganzen Dauer der fast zweijährigen Züchtung, bemerkenswert beständig blieben. Scott (65) hat die Agglutination von 265 Diphtheriestämmen mit Hilfe von Kaninchen- sera geprüft und dabei acht Serotypen aufgestellt. Außerdem wurde eine Anzahl von Stämmen, die vorwiegend bei den Bazillenträgern isoliert wurden, als zu einem be- sonderen Typ angehörig gefunden. Die atypischen Diphtheriestämme sind von den „echten“ Diphtheriestämmen agglutinatorisch unterscheidbar. Es wird vermutet, daß einzelne Diphtherieepidemien durch serologisch verschiedene Typen hervorgerufen werden können. Doyle (34) untersuchte mit einem polyvalenten Diphtherieserum 286 morphologisch gesicherte diphtheriebakterienhaltige Mischkulturen und konnte bei 74.5 % ein be- friedigendes Ergebnis erzielen. 42 virulente Diphtheriestämme wurden aber von sol- chem Serum nicht erfaßt. Bailey (30) gewann Meerschweinchensera, die gegen avirulente Diphtheriebakterien, C. hoffmannii und xeosis gerichtet waren. Keines dieser Sera vermochte die virulenten Diphtheriebakterien zu agglutinieren. Die Sera gegen avirulente Diphtheriebakterien haben mehr oder weniger starke Kreuzreaktionen aufgewiesen, während die Hoff- mann- und Xerosis-Sera sich als streng art-spezifisch erwiesen haben. Weder aviru- lente Diphtherie- noch Hoffmann- oder Xerosis-Bakterien sind imstande, Meer- schweinchen gegen virulente Diphtheriebakterien aktiv zu immunisieren (siehe auch Rosenau und Bailey (63). Kliewe (217) hat die Diphtheriebakterien nach ihrem kulturell-biochemischen Ver- halten in einen Volltyp und fünf Minus- bzw. Minus-Plusvarianten eingeteilt. Er agglutinierte die Vertreter aller dieser Gruppen, sowie neun Pseudodiphtheriestämme mit je drei Kaninchensera, die mit a) einem Volltypstamm (Gruppe la), b) einem Diphtheroid aus einer Pferdewunde und c) einem Pseudodiphtheriestamm hergestellt wurden. Aus den Versuchsergebnissen ersieht man, daß der Volltyp sowie eine Minus- Plusvariante ein Serotyp bilden, der mit dem Diphtherieserum fast bis zu seinem Titer agglutiniert wird. Die Stämme von drei weiteren Diphtherievarianten bilden den zweiten Serotyp mit einem niedrigeren Agglutinationstiter. Endlich, die Stämme der Varianten Ib und If konnten vom Diphtherieserum nicht agglutiniert werden. Aus dem gesamten zahlenmäßig beschränkten Material darf man .nach der Mei- nung des Verfassers keinen allgemeingültigen Schluß über die Serotypen bei den Diphtheriebakterien ziehen. Es könnten an einem größeren Material weitere Sero- typen gefunden werden, was andere Autoren bestätigen könnten. Die Pseudodiphtheriestämme wurden nur von den homologen Sera agglutiniert. Auch Moehrke (50) fand, daß ein mit fünf Pseudodiphtheriestämmen hergestelltes Kaninchenserum die 12 geprüften Pseudodiphtheriestämme gut agglutinierte, während acht avirulente, aber sonst typische Diphtheriestämme unbeeinflußt blieben. Neill und Mitarbeiter (52) konnten in Sera der mit verschiedenen Diphtherie- und Pseudodiphtheriestämmen immunisierten Laboratoriumstiere gruppenspezifische Agglutinine, die von Antitoxin verschieden sind, nachweisen. Nach der Entdeckung von Diphtherietypen durch Anderson u. a. wurden mehrere Untersuchungen über die Frage ihres serologischen Verhaltens angestellt. Ewing (39) konnte bei 106 Gravisstämmen das Vorkommen von fünf Serotypen: A, B, C, D und X nachweisen. Die Serotypen A, B und D stimmen in allen Eigen- schaften mit dem klassischen Gravis überein; Serotyp C weist Abweichungen in der Kolonieform auf, während Typ X kulturell deutlich verschieden ist, ein orangefarbenes Pigment zu bilden vermag und keine Tierpathogenität besitzt. Die Typen A, B und C stammten aus England (drei B-Stämme aus Berlin); zwei D-Stämme waren in Khar- tum (Brit. Sudan) isoliert. 35 Mitis- und 15 Intermedius-Stämme wurden als sero- logisch vom Gravis verschieden und ihrerseits in mehrere Serotypen gespalten gefunden, 14 Murray (51) unterteilte mit Hilfe der Absorption von Agglutininen die 78 Gravis- stämme in 3, 102 Intermedins in vier und 70 Mitis in vier Serotypen; außerdem wurden die nicht typisierbaren Stämme gefunden; zwei Mitisstämme reagierten nur mit ihren homologen Sera. Kreuzreaktionen zwischen einzelnen Typen wurden nicht beobachtet. Robinson und Peeney (62) unterscheiden bei 739 Gravisstämmen aus verschiedenen Ländern fünf Serotypen, von denen vier mit den Serotypen von Swing überein- stimmen. Type I und II sind klassische Gravis; III—V nähern sich in einigen Merk- malen dem Typ Mitis. Type I—III überwiegen bei schwereren Epidemien. I und III dominieren in England und Australien (Typ III wurde auch in Bratislawa-Tschecho- slowakei gefunden); II ist kosmopolitisch verbreitet, IV vorwiegend aus Ägypten, V nur aus USA. Kreuzreaktionen zwischen einzelnen Gravis-Serotypen, sowie mit Intermedius und Mitis wurden beobachtet. Nishimoto (53) hat als Antigen die durch ein 6—20stündiges Schütteln homogeni- sierten Suspensionen von 316 Diphtheriestämmen verwendet. Durch Agglutininabsorp- tion gelang es ihm die geprüften Stämme in 13 Serotypen einzuteilen. Neun Stämme von Diphtheroiden aus Ozaenafällen stimmten agglutinatorisch mit echten Diph- theriebakterien überein; in Absorptionsversuchen konnte aber die serologische Ver- schiedenheit beider Gruppen erwiesen (54) werden. Die Diphtheroide wurden in drei Serotypen aufgeteilt, zwei davon als zu den Diphtherieserotypen X und XIII ver- wandt gefunden. In einer weiteren Arbeit (55) ist gezeigt, daß die Diphtherieanti- toxine, die mit sieben von den gefundenen 13 Serotypen hergestellt waren, alle sieben Serotyp-Toxine gleich gut neutralisierten. Demnach sollen die Toxine aller sieben Serotypen als serologisch identisch betrachtet werden. In China haben Sia und Huang (66) bei 92 Diphtheriestämmen sieben agglutina- torische Serotype durch Kreuzabsorption auf gestellt; drei davon wurden nur durch je einen Stamm vertreten. II. Komplementbindung. Auch die Komplementbindung wurde zur Einteilung von Diphtherie- und Pseudo- diphtheriebakterien in Serotype herangezogen. In neuerer Zeit haben Bull und McKee (33) diese Reaktion bei fünf virulenten, drei avirulenten Diphtherie- und drei Pseudodiphtheriestämmen untersucht. Es wurde mit fallenden Serumdosen gearbeitet, die Komplementbindung erfolgte im Eisschrank über Nacht; es konnte keine scharfe serologische Differenzierung dieser Corynebakterien erzielt werden. Stone (69) fand, daß die Zahl der mit der Komplementbindungsreaktion feststellbaren Serotypen bei Diphtheriebakterien geringer als bei ihrer Agglutination ist. Die Absorption von Diphtherieagglutininen aus den Immunsera entfernt auch die Diphtherieambozeptoren. Zu ganz ungünstigen Resultaten gelangten Bessemanns, de Potter und Decker (32). Als Antigene benutzten sie: erhitzte Diphtheriebakteriensuspensionen, Diphtherie- toxine und -antitoxine. Eine eindeutige Komplementbindung mit diesen Antigenen konnte weder mit den Immun- noch mit den Normalsera von Meerschweinchen und Schweinen erzielt werden. Die Resultate mit Kaninchen-, Pferde-, Hammel-, Rinder- und Menschensera waren zu unbeständig und unspezifisch, um zur Identifizierung von Diphtheriebakterien und ihrer biologischen Produkte dienen zu können. Nach der Aufstellung von Diphtherietypen haben Menton, Cooper und Fussel (49) 200 Diphtheriestämme auf ihr Verhalten bei der Komplementbindungsreaktion geprüft. Formalingetötete Agarkulturen haben dabei als Antigene gedient. Die Antigene aus Stämmen, die bei klinisch schwereren Fällen isoliert wurden, wurden wirksamer als diejenigen von den klinisch leichteren Fällen. Diese klinisch-serologische Gruppierung von Diphtheriestämmen stimmt aber nicht mit der kulturell-biochemischen Typisie- rung von Anderson überein. An einem kleineren Material konnte Stein (68) das Vorhandensein von gemein- samen Rezeptoren bei Diphtherie- und Pseudodiphtheriebakterien feststellen. 15 III. Serologische Individualität der Diphtherietoxine. Es wurde schon mehrfach erwähnt, daß trotz der vorhandenen Unterschiede in der Agglutionogenstruktur bei verschiedenen Serotypen der Diphtheriebakterien ihre Toxine sich immer als serologisch identisch erwiesen haben. Kolle und Schloßberger (44, 45) haben festgestellt, daß das mit einem Diphtherie- toxin gewonnene Antitoxin durch heterologe Diphtherietoxine in gleichen Verhält- nissen wie durch das homologe Toxin gebunden wird. Die Wirksamkeit eines mit lebenden Diphtheriebakterien gewonnenen antibakteriellen Serums ist nicht größer als die eines rein antitoxischen und verläuft parallel zu seinem Antitoxingehalt. Solche antibakteriellen Sera neutralisieren auch die Giftigkeit von heterologen Kulturen und Toxinen. Weiterhin (42, 43, 46) fanden sie, daß das Diphtherieantitoxin auch gegenüber den in vitro gewonnenen „Toluolgiften“ der Diphtheriebakterien wirksam ist. Somit er- weisen sich die Reagenzglastoxine als mit den im Tierkörper wirksamen Diphtherie- toxinen serologisch identisch. Monovalente Antitoxine können in Bindungsversuchen verschiedene Dlm verschie- dener Diphtherietoxine neutralisieren — verschiedene Avidität. Aber dieses Verhältnis der neutralisierten Dlm-Zahl bleibt bei der Verwendung von homologen und hetero- logen Antitoxinen unverändert (Kolle, Joseph und Schloßberger (47)). H. Schmidt (64) betonte, daß die mit den agglutinierenden Diphtheriesera in einer Diphtherietoxin-Bouillon zu erzielende Flockung von der Toxin + Antitoxin-Reaktion unabhängig ist. Das folgt daraus, daß; 1. der Zusatz von agglutinierenden Diphtherie- sera zu derselben Toxinbouillon nach dem Ablauf der Toxin + Antitoxin-Reaktion eine neue Flockung hervorruft; 2. daß nach der vorherigen Ausflockung mit agglutinieren- dem Serum der Flockungswert der Toxinbouillon gegenüber dem Diphtherieantitoxin unverändert bleibt. Okell und Parish (56) konnten 819 virulenter Diphtheriestämme mit demselben ein- zigen monovalenten Diphtherieantitoxin neutralisieren. Povitzky, Eisner und Jackson (59) haben nachgewiesen, daß das Antitoxin Park- Williams 8 in vitro und in vivo die von verschiedenen Diphtheriestämmen gebildeten Toxine Einheit für Einheit neutralisiert, gleich ob sie von schweren oder leichten Diphtheriefällen gewonnen sind. Der Typ Gravis ist insofern virulenter als Mitis, als eine kleinere Bakterienzahl davon Meerschweinchen zu töten vermag, wahrscheinlich einer größeren Invasionskraft und einer schnelleren Toxinproduktion in vivo zufolge. Diese Ergebnisse sind von Etris (38) ergänzt, wonach die von dem Antitoxin Park- Williams 8 neutralisierbaren Gravis-Stämme sich folgendermaßen geographisch ver- teilen: Berlin 100 °/o, Leeds 75—90 °/o, New-York 68—81% und London 62—75% der geprüften Gravisstämme. Dabei entfaltet das Park-Williams 8-Antitoxin eine Schutz- wirkung gegenüber einer Gravisinfektion bei Meerschweinchen. Curt Tarnowski (70) hat den Stamm Park-Williams 8 als einen typischen Mitis - stamm serologisch identifiziert. Beide Stämme lassen sich durch ihre Sera kreuzweise agglutinieren, nicht aber durch Sera anderer Diphtherietypen. Park-Williams 8-Serum übt eine deutliche Heilwirkung auf Infektionen mit allen drei Typen aus. Ebenso schützt ein Park-Willams 8-Anatoxin Meerschweinchen gegen Infektionen mit allen drei Typen. Ugo (71) überprüfte vier verschiedene Diphtherietoxine (zwei aus Milano, eins aus Siena und eins aus Frankfurt a. M.) mit 12 Handelssera. Es wurden immer die gleichen Titerwerte gegen alle vier Toxine bei ein und demselben Serum gefunden. Der Ver- fasser glaubt deshalb, daß die in der Praxis vorkommenden Versager der Diphtherie- Serotherapie nicht auf serologische Verschiedenheiten einzelner Diphtherietoxine zu- rückgeführt werden sollen. Dagegen fand Revelli (61), daß die im Laufe derselben Epidemie direkt von Kran- ken isolierten Diphtheriestämme durch ein bestimmtes antitoxisches Diphtherieserum 16 verschieden stark neutralisiert werden können. Die Toxine der die Bouillon alkali- sierenden Stämme sind stärkere Antigene als die Gifte der bouillon-säuernden Stämme. Isiyama (73) konnte zwischen den Toxinen von Stämmen, die von den schweren „toxischen“ Diphtheriefällen gezüchtet wurden und den von den Diphtheriestämmen von „gewöhnlichen“ Diphtherieerkrankungen keine qualitativen Unterschiede fest- stellen. Er berichtet aber über eine quantitativ stärkere Toxinbildung bei „toxischen“. Stämmen. Die Frage der Toxinverschiedenheit von einzelnen Diphtheriebakterientypen wurde auch von Clauberg untersucht (72). Er hat 46 Toxine von verschiedenen Diphtherie- bakterientypen im Kaninchenversuch nach Jensen vergleichend geprüft. Die Beobach- tungen sprechen zugunsten der Auffassung über die Verschiedenheit der Toxine ein- zelner Typen. Die Frage, ob es sich dabei um qualitativ differente Partialtoxine han- delt, die für die betreffenden Typen verschieden sind, oder ob sich die verschiedenen Typtoxine durch ihre verschiedene Neigung zpr Toxin-Toxoid-Umwandlung unter- scheiden, ließ sich zur Zeit nicht beantworten. 4. Porphyrine und Flavine. 1931 isolierten C. Coulter und F. Stone (76) aus den Berkefeldkerzen-Filtraten der Diphtheriekulturen zwei Porphyrine. Das eine wurde aus dem Ätherextrakt des keim- freien Filtrats mit Hilfe von 5 u/o HCl gewonnen und als Koproporphyrin identifiziert. Das andere, das in HCl unlöslich ist und blauviolette Lösungen ergibt, zerfällt bei Hydrolyse in Koproporphyrin und "eine Cu-Verbindung des Koproporphyrins. Dieser Gehalt der Diphtheriekulturen an komplexen Porphyrinen war ihrem Flockungsvermögen nach Vermischung mit antitoxischem Serum parallel. Die Verfasser vermuteten, daß in der Bakterienzelle das Toxin eine Art von kolloidalem Träger darstellt, der nach Ver- bindung mit dem Porphyrin, das Cytochrom ergibt. Diese Vermutung wurde durch Be- obachtungen an verschiedenen Diphtheriestämmen erhärtet (Coulter und Stone (77)), wonach die Intensität der cytochromähnlichen Absorptionsbänder im toxinhaltigen Bouillonfiltrat parallel zu ihrem Toxingehalt verlief; in Kulturfiltraten von atoxisehen Diphtheriestämmen und von Xerosebakterien fehlten diese Bänder. Drei Jahre später bestätigten C. Levaditi, Loiseau, Paic, Philippe und Haber (83) diese Befunde insoweit als sie in der toxinhaltigen Bouillon ein Absorptionsband mit Maximum bei 4080 Ä beobachteten, das in der sterilen oder mit atoxischen Diphtherie- stämmen beimpften Bouillon nicht vorkam. Das Rarnonsche Anatoxin absorbiert das Licht stärker, aber die Absorptionskurve ist der des Toxins fast analog. Dieses im äußersten Violett absorbierende Pigment muß in seinem Molekül Pyrrholgruppen ent- halten. Beim Dialysieren durch die Kollodiummembran wird es teilweise durch diese absorbiert, zum Teil aber passiert es sie, und zwar rascher als Toxin (M. Paic und M. Philippe (87). Seine Anreicherung in Bouillon geht in der Vermehrungsphase der Keime der Toxinbildung parallel; wenn sich das Toxin abzuschwächen beginnt, ver- ringert sich die Menge des Pigments nicht. Auch diese Autoren fanden, daß es sich da- bei um Koproporphyrin handeln muß (M. Paic (85, 86)). Das Band bei 4080 Ä gehört dem Koprohämochromogen, dessen stickstoffhaltige Base wahrscheinlich ein Purin ist. Bei der Extraktion mit angesäuertem Äther wird aus dem Hämochromogen das Eisen abgespalten. Dabei verschwindet nach dem HCl-Zusatz das Band 4080 Ä in der Äther- phase; es tritt dagegen ein neues bei 3980 Ä auf, das dem Cu-Komplex des Kopropor- phyrins und ein anderes bei 4035 Ä, das dem Koproporphyrin I angehört. Zu ähnlichen Ergebnissen kamen auch A. Wadsworth, M. Crowe und L. Smith (89), denen es gelang, das Pigment durch Ultrafiltration, teilweise durch Adsorption an Tierkohle, völlig vom Toxin zu trennen. Sie erhielten dasselbe Porphyrin auch in den toxinhaltigen Kulturen, vom synthetischen Nährboden. Alle toxischen Filtrate fluores- 17 zierten rot, die nicht toxischen grün. Der Porphyrinzusatz zu dem Nährboden beein- flußte weder das Wachstum noch die Toxinerzeugung der Diphtheriebakterien (M. Wheeler und M. Crowe (90)). Die Ätherextrakte aus der toxinhaltigen Peptonbrühe, mit 5,4 o/o HCl behandelt, erschienen bei Bestrahlung mit ultravioletem Licht blau- violett mit einer hellroten Fluoreszenz, deren Spektrum drei deutliche Maxima bei 3951, 6160 und 6502 Ä aufwies (M. Crowe (74)). F. Ottensooser, A. Krupski und F. Almasy (84) bestätigten nochmals alle diese Be- funde und fanden außerdem, daß das Spektrum des Pigments zwischen 3400 und 6400 Ä mit dem des Pyridinhämochromogens weitgehend übereinstimmt. Der Hämo- chromogengehalt der geprüften Toxinflltrate lag bei ca. 0,7 mg °/o. Reingewinnung, chemische und spektrographische Eigenschaften dieses Porphyrins wurden auch von Dhere und Mitarbeitern (80, 81) beschrieben. Die weitere chemische Analyse dieses Pigments führten Coulter und Stone selbst durch. Sie fanden in den alkalischen (1-n NaOH-) Extrakten aus Diphtheriebakterien ein Hämochromogen, das dem Cytochrom c nahesteht. Zu diesem Pigment und zu dem durch Extraktion mit Essigsäure und Äther gewonnenen Koproporphyrin gesellt sich noch ein a-Haematin und Lykopin hinzu (Coulter und Stone (78)). Das Metall-Kopropor- phyrin, das auch im Alttuberkulin vorkommt, erwies sich bei weiterem Studium als Zinkkoproporphyrin, dessen oxydierte Form farblos ist (Coulter und Stone (79)). Seine Absorptionsbänder sind von denen des Fe- bzw. Cu-Koproporphyrins verschieden. Ch. Dhere und A. Gourevitch (82) wiesen in der diphtherietoxinhaltigen Bouillon 0,108—0,36 mg °/o Flavin nach, in der Bouillonkultur eines giftlosen Stammes 0,33 mg a/o and im Handelsanatoxin Spuren bis 0,08 mg °/o Flavin. M. Crowe (75) behandelte den Ätherauszug des Toxinultrafiltrats (aus einer synthetischen Nährlösung gewonnen) mit Chloroform zwecks Entfernung von Porphyrinen und anderen farbigen Sub- stanzen. Nach der chromatographischen Adsorption des Chloroformextraktes erhielt man eine kanariengelbe fluoreszierende Substanz, die sich als ein noch nicht identi- fiziertes Flavin erwies. F. Urban und M. D. Eaton (88) versuchten, alle diese gefundenen Pigmente in einen Zusammenhang miteinander zu bringen. Wenn sie zu einer Lösung des Coulterschen Diphtherieporphyrins das reduzierte Cytochrom c oder Laktoflavin zugaben und das Gemisch bei 37 0 und pH = 7,9 hielten, verschwanden die Bänder des Porphyrins bei 5740 und 5630 Ä sofort. Auch ein anderes aus dem Diphtherietoxin isoliertes Por- phyrin vom Typ des Cytochroms b wird in Anwesenheit des reduzierten Cytochroms c oxydiert. Das oxydierte Cytochrom c dagegen, das das dreiwertige Eisen enthält, ver- mag weder das Coultersche Porphyrin noch das cytochromartige Porphyrin von Eaton zu verändern. Diese sehr komplizierten und noch nicht restlos geklärten Verhältnisse deuten jedenfalls auf eine große Rolle beider Pigmentarten — Porphyrinen und Flavinen — hin, die wahrscheinlich die der Atmungsfermente der Diphtheriebakterien sein muß. Die von Coulter aufgestellte Behauptung vom Diphtherietoxin als einer Art von Apo- ferment der Diphtherie-Cytochrome ist sehr interessant, wurde aber bisher leider experimentell nicht weiter nachgeprüft. 5. Nukleinsäuren und Polkörnchen. Die ersten Befunde über die Anwesenheit von Nukleinsäuren in den Diphtherie- bakterien stammen von Aronson (loc. cit.), der die entfetteten Bakterien mit NaOH auszog, die Extrakte mit Essigsäure ausfälite, in dem erhaltenen Filtrat dann die Nukleinsäuren mit saurem Alkohol fällte. Damit erhielt er aus 10 gr Bakterien 0,22 gr einer Substanz, die phosphorhaltig war, Xanthinbasen enthielt und nach Hydrolyse mit HCl Pentosen ergab. 18 A. Meyer und Grimme (zit. nach Schumacher) (105) erkannten die Diphtheriepol- körnchen als mit dem in verschiedenen Bakterienarten vorkommenden Volutin iden- tisch. A. Meyer fand, daß das Volutin in kaltem Wasser und Fettlösungsmitteln schwer, in heißem Wasser, Alkalien, Mineralsäuren und Hypochlorit leicht löslich ist; von Pepsin und Trypsin wird es nicht angegriffen. Auf Grund seiner mikrochemischen und färberischen Versuche schloß er auf die Nukleinsäurenatur des Volutins. J. Schumacher (105) bestätigte mit Hilfe mehrerer färberischer Reaktionen (mit OsCl4, RuC14, Methylenblau und Phosphin- bzw. Chinin-Entfärbung,* sowie p-Amino- phenol) diese Befunde von Meyer. Er vermutete außerdem, daß die Nukleinsäure der Diphtheriepolkörnchen in freiem Zustande in den Bakterien vorliegen muß. Ob da- neben noch etwa zu Nukleoproteiden gebundene Nukleinsäuren in ihnen Vorkommen, ließ er unentschieden. Die chemische Natur der Nukleinsäuren der Diphtheriebakterien wurde von R. D. Coghill und D. Barnes (92) untersucht. Sie gewannen aus trockener Diphtheriebakterienmasse 0,81 °/o Nukleinsäuren. Diese enthalten 14,39—14,73% N; 7,82—8,28% P; 9,32—9,50% Guanins; 12,4—13,8% Pentosen, außerdem Zytosin, Urazii und Thymin, aber kein Adenin. Nach dem Ausfall der Feulgenschen Reaktion sind die Diphtheriebakterien-Nuklein- säuren bis zu 26—29 % nach dem Typ der Thymonukleinsäure aufgebaut. Der Haupt- anteil ist aber vom Typ der Hefenukleinsäure. K. Pesch (103) untersuchte den Einfluß der Zusammensetzung des Nährbodens auf die Bildung der Polkörnchen bei Diphtheriebakterien. Er fand im allgemeinen, daß, je nährstoffreicher der Nährboden, desto üppiger das Wachstum und geringer die Pol- körnchenbildung wird, und umgekehrt. Besonders der Asciteszusatz übte eine stark hemmende Wirkung auf die Ausbildung der Polkörnchen aus bei gleichzeitiger Ver- stärkung des Wachstums der Bakterienzellen. Pesch unterstützte die Auffassung über die Nukleinsäurenatur der Polkörnchen besonders dadurch, daß auf den phosphat- bzw. nukleinsäurehaltigen (ascitesfreien) Nährböden die Entwicklung der Polkörnchen immer deutlich verstärkt war im Gegensatz zu den phosphorarmen Substraten. F. Lentze (100) beobachtete eine beschleunigte und verstärkte Ausbildung der Pol- körnchen bei Diphtheriebakterien, sowie ein verstärktes Wachstum der Keime selbst bei ihrer Züchtung in einer Atmosphäre, die 1.10”5 bis 1.10”4 Mol H2S pro Liter ent- hielt. Bei höheren Konzentrationen des Schwefelwasserstoffs trat eine Wachstums- hemmung ein, und bei 2.10”4 Mol H2S pro Liter hörte das Wachstum überhaupt auf. Da ähnliche Polkörnchenvermehrung auch bei der anaeroben Züchtung der Diphtherie- bakterien auftrat, und bei den streng aeroben Pseudodiphtheriebakterien weder H2S noch die Anaerobiose irgendwelche Änderungen in der Wachstumsstärke und Pol- körnchenbildung hervorrufen konnten, vermutet Lentze in Analogie zu den Beobach- tungen von E. Negelein (102) über die Atmungshemmung der Hefe unter Einwirkung von H2S, daß auch im Falle der Diphtheriebakterien die beobachteten Effekte mit einer partiellen Atmungshemmung bzw. einer erzwungenen anaeroben Lebensweise in Zusammenhang stehen müssen. F. Lorentz (101) überprüfte die wachstumsbegünstigende und die Polkörnchenbil- dung anregende Wirkung verschiedener chemischer Substanzen auf Diphtheriebak- terien, die auf gewöhnlichem Fleischwasseragar mit entsprechenden Zusätzen gezüch- tet wurden. Von den geprüften Salzen förderten NaHCOa und NaCl in den ange- wandten Konzentrationen das Wachstum, während die Polkörnchenbildung nicht wesentlich verändert wurde. Andere Salze (KCl, CaCl2, Na2CG3, CuS04, K2Te03) wirkten auf beide Funktionen abschwächend. Milch-, Fleisch- sowie Hühner-Proteine und das Witte-Pepton verstärkten das Wachstum; die Ausbildung der Polkörnchen wurde dabei umso stärker gehemmt, je üppiger das Wachstum war. Von Kohle- hydraten und ihren Abbauprodukten förderten die Glukose, Laktose, sowie Milch- säure und Glyzerin das Wachstum und die Polkörnchenbildung (besonders Glyzerin) im 3 % Agar. Alle geprüften Lipoide (Stearin-, Na-oleat, Schmierseife, Cholesterin 19 und Lezithin) beschleunigten trotz des sehr üppigen Wachstums auch die Polkörnchen- bildung bedeutend. Besonders stark wirkten Cholesterin und Lezithin. Unter den schwefelhaltigen Körpern wurde im Gegensatz zu Lentze, Braun u. a. bei Anwendung von H2S und Schwefel eine Wachstumshemmung (bei gleichzeitiger Polkörnchenverstärkung) beobachtet. Zystin förderte das Wachstum und die Pol- körnchenentwicklung. Interessant sind die Beobachtungen, daß auch der sog. „Nur- Agar“, d. h. Agar ohne Fleischwasser- und Peptonzusatz, eine gewisse, wenn auch spärliche Entwicklung der Diphtheriebakterien mit stark ausgeprägten Polkörnchen ermöglicht. Man kann zur Zeit nicht mit Sicherheit entscheiden, welche Rolle den Polkörnchen bei den Diphtheriebakterien und anderen sie ausbildenden Keimen zukommen kann — Reservestoffe, Kernäquivalente, Sporenrudimente usw.? Nachdem T. Caspersson (91) seine Mikromethodik zum Nachweis der minimalsten Mengen von Nukleinsäuren, so- wie der verschiedenen Kern- und Zytoplasmaproteine mit Hilfe der Absorptionskurven im Ultraviolett ausgearbeitet hat, eröffnet sich damit eine neue Möglichkeit zur Auf- klärung vieler mit der Chemie und Physiologie der Polkörnchen und anderer Nukleo- tiden bei Diphtheriebakterien zusammenhängender Fragen. Es sei hier noch auf eine andere Körnelung hingewiesen, die in den Zelleibern der grampositiven Bakterien, darunter auch der Diphtheriebakterien (in geringerer Menge auch bei den „diphtheroiden“, und sogar bei den „echten“ Pseudodiphtheriebakterien — C. hoffmannii) vorkommt. Sie wurde von H. Dold (93—95) und seinen Schülern Kraft (99) und Rabe (104), sowie einigen anderen Verfassern in einer Reihe von Ar- beiten beschrieben. Diese Körnchen sind nur färberisch, also rein morphologisch cha- rakterisiert. Nach einer Karbolanilingrünfärbung mit nachfolgender Lugol-Behand- lung, entfärben sich meistens die Zelleiber der Diphtherie- und Pseudodiphtherie- bakterien bei nachfolgender Differenzierung mit einer Harnstoff-Alkohol-Lösung in einer Weise, daß nach einer Kontrastfärbung mit Bismarckbraun die entfärbten Zellen und Zellteile gelb, die harnstoff-alkoholresistenten aber grün erscheinen. Besonders charakteristisch für die jungen (bis sechs Tage alten) Diphtheriekulturen ist das ephemere, unregelmäßig periodische Auftreten der grünen „Dold-positiven“ Körner inmitten des negativen gelben Körpers. Diese Körner entwickeln sich ganz regelmäßig und üppig mit dem Altern der Kulturen. Besonders günstig für ihre Ausbildung fand man das Einhalten des Temperaturoptimums bei 37 °, sowie des pH = 6,5—7,5. Über die chemische Natur dieser Gebilde, sowie über ihre physiologische Bedeutung ist nichts bekannt. Von Interesse ist der Befund von II. Dold und D. H. Du (96, 97), daß in den alternden Diphtheriekulturen parallel mit der Anreicherung und Stabili- sierung der „Dold-Körnchen“ auch eine Vermehrung der Säure-Alkohol-resistenten Elemente (Färbung nach Ziehl-Neelsen) stattfindet. Diese von Dold vorgeschlagene Einteilung der grampositiven Mikroben in „Dold- positive“ und „Dold-negative“, sowie das Auffinden der „Dold-Körnchen“ in „Dold- negativen Zelleibern“ ist offenbar eine rein morphologische Angelegenheit, die wahr- scheinlich durch die lokalen Unregelmäßigkeiten in der Bindungsfestigkeit des Farb- stoffs sowie durch die verschiedenen Permeabilitätsverhältnisse der Zellmembranen, nicht aber durch die Anwesenheit eines bestimmten chemischen Körpers bedingt ist. Nach R. J. Henke (98) besteht das Wesen dieses Verhaltens von Diphtherie- bakterien und anderer grarapositiven Bakterien in ihrer verschieden stark aus- geprägten Bindungsfestigkeit dem Karbolanilingrün gegenüber (verstärkt durch die Nachbehandlung mit Lugollösung), gemessen an dem Grad der Entfärbbarkeit mit Äthanol. Der Zusatz von Harnstoff sei nicht unbedingt notwendig; die Schnelligkeit und Intensität der Entfärbung hängen nur von dem Wassergehalt des Alkohols ab, wobei die Alkoholkonzentration von 88 n/o und Entfärbungsdauer von fünf Minuten als optimal gefunden wurden. Nach dieser Zeit entfärbt sich nur ein Teil von Diph- Iheriebakterien, während der andere seine Farbe beibehält. 20 III. Physiologische Grundleistungen 1. Verwendungsstoffwechsel und Wuchsstoffe. Die Erforschung der physiologischen Lebensäußerungen der Diphtheriebakterien kann nicht mit sicherem Erfolg auf den in der diagnostischen und industriellen (Toxin- produktion) Praxis verwendeten gewöhnlichen Nährböden betrieben werden. Diese Nährböden enthalten zu viele chemisch ungenügend definierte Substanzen, wie z. B. verschiedene Serum-, Blut- und Organproteine, Peptone, Fleischextrakte usw. Man kann in diesen Medien die Rolle einzelner chemischer Körper beim Wachstum der Bakterienzellen und beim Zustandekommen ihrer verschiedenen morphologischen und physiologischen Eigenschaften nicht richtig beurteilen. Daraus entstand ein Bedürfnis nach den sog. „synthetischen“ Nährböden, die nur chemisch einfache und gut definierte Substanzen enthalten. Diese Media enthalten das allernotwendigste Minimum der von den Diphtheriebakterien zur Deckung ihres Stoff- und Energiebedarfs benötigten Ausgangsprodukte. Diese Stoffe müssen auch zum Auf- bau der Bakterienzellen und ihrer lebenswichtigen Wirkstoffe ausreichen. Für das Studium der Zusammensetzung solcher Nährböden haben in neuerer Zeit in erster Linie die Schulen von H. Braun (Frankfurt a. M.) und von H. J. Mueller (Boston) besonders wertvolle Beiträge geliefert. Ausgehend von den Arbeiten älterer Autoren [Uschinski, C. Frankel, Hodley und Gorbam, v. Gröer, Leichtentritt und Zielaskowski, Hosoya und Kuroya-zit. nach H. Braun und F. Mündel (108)] und eigenen Untersuchungen über den Verwendungs- stoffwechsel anderer pathogener Bakterien untersuchte H. Braun mit seinen Mitarbei- tern (107, 109, 110) die minimalen Ernährungsbedürfnisse der Diphtheriebakterien. Die von Braun untersuchten Stämme erwiesen sich als ziemlich anspruchsvoll. Nur die Asparagin- und Glutaminsäuren, ihre Salze und das Asparagin wurden von den Diphtheriebakterien als Stickstoffquellen verwertet. Keine andere Aminosäure weder sonstige organische noch anorganische N-Verbindungen können diese Substanzen bei der Züchtung von Diphtheriebakterien in synthetischen Lösungen ersetzen. Die mini- mal notwendige Konzentration an diesen zweibasischen Aminosäuren beträgt ca. 125 mg °/o. Die Bedeutung dieser Befunde ist erst jetzt im Lichte der modernen ferment- chemischen Untersuchungen klar geworden, denen zufolge die Glutaminsäure (in kleinerem Umfange auch die Asparaginsäure) den Mittelpunkt bei der Synthese von Aminosäuren im pflanzlichen und tierischen Organismus einnehmen [Zusammen- fassende Darstellungen bei W. Franke (125), T. Wieland (163) u. a.J. Mit Hilfe der Enzyme Glutamin bzw. Aspartico-Aminopherase, die z. B. in Hefen und Colibakterien nachgewiesen wurden, werden die entstehenden Aminogruppen der Glutamin- bzw. Asparaginsäuren auf die entsprechenden a-Ketosäuren übertragen und dadurch wird die biologische Synthese einiger Aminosäuren bewirkt: R. Rn R. R0 r i2 i1 i2 CO \ CO CH.NHa I +1 \ I + I " COOH COOH COOH COOH Wenn in einer synthetischen Nährlösung Glutaminate oder Asparaginate vorhan- den sind, bilden sie das NH2-liefendere Depot, aus dem die im intermediären Stoff- 21 Wechsel anfallenden a-Ketonsäuren mit Aminogruppen versehen und dadurch in die in der Nährlösung nicht vorhandenen, für die Eiweißsynthese aber nötigen Amino- säuren umgebaut werden. Außer den erwähnten dibasischen Aminosäuren brauchen die Diphtheriebakterien zu ihrem Wachstum noch unbedingt das Zystin. Die minimale Konzentration beträgt 2—3 mg°/o, die optimale ca. 12,5 mg V«, Das Zystin (H. Braun und F. Mündel (111); F. A. Lentze (100)) wirkt wahrscheinlich nicht als Stickstolfquelle, sondern hauptsächlich als ein Redoxkörper, gemäß seiner Fähigkeit zur Ausbildung eines Gleichgewichts CH CIL CH_ I 8 I 8 I 8 2 CH.SH. HC —S S CH I \ 1 I CO OH COOH COOH Dabei ist die ausschlaggebende Rolle der Sulfhydryl-Gruppe des Zysteins zu be- tonen, an der sich die eigentliche Dehydrierung (mit Bildung der Disulfidgruppe — S — S —) ab spielt. Die Lage dieses Gleichgewichts beeinflußt weitgehend die Redoxverhältnisse inner- halb und außerhalb der sich entwickelnden Zellen und bestimmt die Richtung vieler enzymatischer Reaktionen (H. Büsing (113)). Das Zystin wird mit Erfolg durch andere organische und sogar anorganische schwefelhaltige Körper ersetzt, so z. B. durch H2S, Schwefelblüte, Thioglykol- und Thiomilchsäure. (H. Braun (110), C. J. Tietz (160)). In ihrer Anwesenheit entwickeln die Diphtheriebakterien Schwefelwasserstoff. Die von H. Braun untersuchten Stämme der Diphtheriebakterien vermehrten sich, wenn auch nicht besonders üppig, in einer Lösung, die außer den anorganischen Salzen nur 125 mg % Na-asparaginat und 12,5 mg fl/o Zystin enthielt. Wenn zu dieser Grundlösung gewisse Substanzen zugesetzt wurden, deren Zugabe das Wachstum der Diphtheriebakterien schneller und üppiger machte, wurde somit ihre Verwertbarkeit durch Diphtheriebakterien als nachgewiesen betrachtet. In dieser Weise geprüft, haben sich von den Salzen der organischen Säuren: Acetate und Lactate, von den mehr- wertigen Alkoholen; Glyzerin und von den Zuckern: Glukose, Fruktose und Maltose als verwertbar erwiesen; nicht aber Ameisen-, Propion-, Oxal-, Wein- und Zitronen- säure, Mannit und Saccharose. Das gibt eine gewisse Vorstellung über die in Diph- theriebakterien vorkommenden glykolytischen Fermente und Dehydrasen. Besonders wichtig war die Feststellung, daß von den geprüften anorganischen Substanzen die Ionen Na| K,’ Mg”— CI.’ und SO” für die Diphtheriebakterien völlig entbehrlich sind. In einer späteren Arbeit findet aber Braun (112), daß das Mag- nesiumion für anspruchslose Diphtheriestämme unentbehrlich ist. Die Phosphate sind lebenswichtig und in ihrer Abwesenheit kommt kein Wachstum zustande. Das ist auch leicht einzusehen, nachdem die gewaltige Rolle des Phosphors bei den wichtigsten energieliefernden Vorgängen in allen Zellen erschlossen wurde (s. z. B. F. Lynen (139)). Mindestkonzentration des Phosphats in einer synthetischen Lösung, die zum Diph- theriebakterienwachstum ausreicht, beträgt 10 mg °/o. Von anderen Bestandteilen betont H. Braun die Notwendigkeit minimalster Eisen- mengen, denen er die Rolle eines Katalysators der Zystein- und Glutathionoxydation zuschreibt, die aber in Wirklichkeit wahrscheinlich viel umfangreicher ist. Größere Mengen Eisen hemmen das Wachstum der Diphtheriebakterien. Das pH-Optimum in synthetischer Lösung wurde gleich 7,6—8,2 gefunden. Auf diesen Ei'kenntnissen baute H, Braun seine vollwertige synthetische Lösung zur Züchtung der Diphtheriebakterien auf. In diesem Substrat züchtete er seine Stämme in «weit mehr als 100 Passagen und hat dabei keine größeren Veränderungen in ihrer Morphologie und Virulenz festgestellt. Die Toxinbildung aber war sehr 22 schwach oder fehlte sogar. Außerdem gelang die Züchtung nur aerob. Nicht alle Diph- theriestämme wuchsen in diesem Nährboden, besonders die älteren Laboratoriums- stämme gingen dort nicht an. Auf Grund ihres Verhaltens gegenüber seiner syntheti- schen Nährlösung teilt Braun alle Diphtheriestämme in anspruchslose und anspruchs- volle ein. H. Schmidt (158) ergänzte diese Befunde insoweit, daß er die breitere (pH = 5,9—9,4) und engere (pH = 6,2—8,9) verträgliche und die optimale (pH = 7,8—8,3) pH-Wachs- tumzonen für fünf anspruchslose Diphtheriestämme in der synthetischen Asparagin- säure + Zystin + Acetat-Nährlösung feststellte. Außerdem bestätigte er an drei neuen Stämmen die wachstumsfördernde Wirkung von Lactat, Succinat, Glyzerin und klei- neren Konzentrationen (bis 1 °/o) von Glukose. Er bestätigte, daß nur Asparaginsäure und in geringerem Maße das Asparagin und die Glutaminsäure den geprüften Stäm- men als N-Quelle dienen können. Glykokoli, Alanin, Valin, Serin, Prolin, Histidin, Tryptophan und Glyzylglyzin erwiesen sich als unfähig, den Diphtheriebakterien Wachstum zu ermöglichen. Von den anspruchsvollen Stämmen, worunter sich einige gute Toxinbildner (in gewöhnlicher Bouillon) befanden, ließen sich keine anspruchs- losen Tochterstämme abdissoziieren. Die Düsseldorfer Forscher A. und G. Hottinger (135), sowie J. Nitsch (156) vertieften und ergänzten diese Studien über den Verwendungsstoffwechsel der Diphtheriebak- terien. Sie fanden, daß zwischen den untersuchten zehn „gewöhnlichen“ und zehn „toxischen“ Diphtheriestämmen keine Unterschiede in der Verwertung einzelner ihnen dargebotenen Substanzen, sowie in den bei ihrem Abbau auftretenden Endprodukten vorgekommen waren. Die meisten dieser Stämme gingen in der Braunschen syntheti- schen Lösung an. Die Aminosäuren bildeten für sie nicht nur die einzige Stickstoff-, sondern auch eine wesentliche Energiequelle. Die Aminosäuren wurden dabei desami- niert und oxydiert. Bis zu 40 e/o der im Nährboden vorhandenen Aminosäuren wurden abgebaut unter Bildung von NH3, COo und organischen Säuren. Dabei stieg das pH der Lösung an. Aber der Stickstoffansatz der Kulturen war gering; nur 5 °/o des ange- botenen Stickstoffs wurde in die Zellsubstanz eingebaut. Von einzelnen Aminosäuren wurden am besten Asparaginsäure und Zystin ver- wertet, weniger gut Arginin und Tryptophan. Die Toxinbildung erfolgte nur in zystin- haltigen Lösungen. Beim Vorhandensein von zwei Grundaminosäuren (Asparaginsäure und Zystin) för- derten Ammoniumsuccinat, Harnstoff und Glukose das Wachstum der Bakterien. Der Zusatz von Pepton (auch von Peptonhydrolysat) führte zu einem üppigeren Wachstum und besserer Toxinbildung. Aus der Gasphase über der Kultur verbrauchten die Diphtheriebakterien den Sauerstoff, nicht aber Stickstoff und Kohlendioxyd. Die Proteine der in der synthetischen Lösung gezüchteten Diphtheriebakterien wichen von derjenigen der Bouillonkulturen insofern ab, als sie besonders an Trypto- phan reich waren. F. Lieb und W. Reichelt (138) untersuchten den Abbau einiger Aminosäuren durch die Aufschwemmungen der Diphtheriebakterien mit Hilfe des kolorimetrischen Ver- fahrens nach Folin und fanden, daß diese Keime am stärksten das Asparagin ersetzen. Die Spaltung von Alanin und Glykokoli war viel schwächer und kam nicht bei allen Stämmen vor. Asparaginsäure und Tyrosin wurden nur ausnahmsweise gespalten. 1933 begann H. J. Mueller (140) mit seinen Mitarbeitern eine Reihe von umfang- reichen Studien über den Verwendungsstoffwechsel der Diphtheriebakterien. Zuerst stellte er für einen Stamm („Ho-Yu“) fest, daß für sein Wachstum außer Tryptophan, Zystin, sowie Äthanol als C-Quelle, noch zwei nicht näher bestimmte Substanzen un- entbehrlich sind. Die erste befand sich in der Prolinfraktion des Schwefelsäurehydroly- sats des Kaseins, die andere, die keine Base war, im Liebigs Fleischextrakt. In wei- teren Untersuchungen (141, 142) fand er, daß außer Tryptophan und Zystin noch fol- gende Aminosäuren wachstumsfördernd wirken; Methionin (2,5—7,5 mg °/o, Histidin 23 und Glutaminsäure. Auch die anderen Aminosäuren: Phenylalanin, Glykokoll und dl-Valin können das Wachstum der Diphtheriebakterien steigern, aber nur in Gegen- wart von Methionin, einer schwefelhaltigen Aminosäure, die zusammen mit dem Zystin die S-Quelle für die Diphtheriebakterien darstellt. Weiterhin wurden in bezug auf die unentbehrlichen Aminosäuren deutliche indi- viduelle Unterschiede bei einzelnen Stämmen beobachtet. Nach einer Anpassung an das Substrat wuchsen die geprüften Stämme üppiger als im Anfang. In weiterer Verfolgung seiner Studien richtete H. J. Mueller (143) seine Aufmerk- samkeit auf die Bedeutung der d-Glutaminsäure. Er fand, daß sie weder beim Ho-Yu noch bei den Park-Williams-Diphtheriestämmen in der Nährlösung fehlen durfte. Sie wurde in auffallend großen Mengen benötigt. Die synthetische dl-Glutaminsäure be- saß nur eine Hälfte der Wirksamkeit der natürlichen d-Glutaminsäure, was bedeutet, daß nur der d-Anteil wirksam ist. In einer synthetischen Lösung (144, 145), die die obengenannten Aminosäuren, eine bestimmte Salzmischung und etwas Äthanol (oder Glyzerin) als C-Quelle enthielt, wirkte eine Substanz auf Diphtheriebakterien deutlich wachstumsfördernd, die aus der gegen perniziöse Anämie wirksamen Fraktion des Leberextrakts durch Adsorption an Notit und Elution mit Säurealkohol gewonnen wurde — „Lebereluat“. Dieses Leber- eluat erwies sich als dem Liebigs-Fleischextrakt gleichwertig. Bei weiteren Reinigungsversuchen (146, 147) des Lebereluats, die mit einem beson- ders schnell wachsenden, hochvirulenten, aber fast kein Toxin bildenden Stamm- „Allen“ durchgeführt wurden, gewann man zwei Fraktionen, die nur kombiniert die volle Wirkung auf das Keimwachstum ausübten. Die in Äther lösliche Substanz erwies sich als mit der Pimelinsäure COOH • (CH2)5 * COOH identisch. Ihre optimale Konzentration im Nährboden beträgt 2,5 mg °/o. Die anderen diabasischen Säuren (von Oxal- bis Azelainsäure) wirkten nicht auf das Diphtherie- bakterienwachstum. Wenn die Pimelinsäure abwesend ist, brauchen die Diphtherie- bakterien zu ihrem Wachstum des Vorhandenseins von Biotin. Wahrscheinlich syn- thetisieren die Diphtheriebakterien ihr Biotin aus der Pimelinsäure, da der Zusatz dieses Wuchsstoffs in Anwesenheit der Pimelinsäure völlig entbehrlich ist und ihr Zu- satz steigert das Wachstum nicht. Der optimale Gehalt an diesen Substanzen ist 15 -f o/o (du Vigneaud und Mitarbeiter) (120). Von anderen wachstumsfördernden Bestandteilen des Lebereluats ist Nikotinsäure bekanntgeworden, die aber schwächer als Pimelinsäure wirksam ist. Nikotinamid wirkt noch schwächer (148—150). Weiter ist das ß -Alanin anzuführen, das auch im Vakuumdestillat des Leberextrakts vorkommt. Das 1-Carnosin kann das ß-Alanin er- setzen, da das ß-Alanin aus dem 1-Carnosin (nicht aber aus seiner d-Form) durch enzymatischen Abbau entsteht (151). Die Diphtheriebakterien benötigen das ß -Alanin wahrscheinlich für den Aufbau von Panthothensäure (J. H. Mueller and W. Klotz) (154). Weitere Verbesserungen des synthetischen Nährbodens durch Zusatz von d-Milch- säure und sehr kleinen Mengen von Fe, Mn, Cu und Zn (152) haben die Ausbeute an Diphtheriebakterien für den Stamm „Allen“ verdrei- bis vierfacht (ca. 9 mg bak- teriellen Stickstoffs pro 10 ccm Nährboden). Auf solchen Nährböden wuchsen die Stämme Ho-Yu, Park-Williams und Allen; aber für gewisse Diphtheriestämme, besonders für die Mehrzahl frisch isolierter, fehlte noch eine wichtige Wachstumssubstanz, unbekannter Natur,die im Blut vorhanden ist (150—153). Man vermutet, daß für gute Kolonienentwicklung gewisser Stämme, be- sonders vom Typ Gravis, noch zwei oder mehrere Stoffe notwendig sind. Diese Stoffe, die im Pferde- und Rinderserum (nicht aber im Menschen- und Schweineserum) ent- halten sind, werden durch die Proteingerinnung nicht zerstört. Sie sind nicht dialy- sabel. Mindestens einer davon ist im Äthanol und Aceton löslich, die anderen im 24 Wasser. Die acetonlösliche Fraktion ist mit der Ölsäure identisch (118, 119), die in einer Konzentration von ca. 5.5 mg % optimal wirkt; die Konzentrationen von ca. 25 mg % hemmen schon das Wachstum. Der wasserlösliche Faktor wurde noch nicht identifiziert; er ist gegenüber heißen Säuren und Laugen relativ unbeständig. Man sieht aus der obigen Zusammenstellung, wie mannigfaltig und von Stamm zu Stamm verschieden die Wuchsstoffbedürfnisse der Diphtheriebakterien sind. Man kann sich zur Zeit noch kein vollständiges Bild darüber machen, auch nicht über die physio- logische Rolle aller bisher entdeckten Wuchsfaktoren. Es ist sehr wahrscheinlich, daß die Niktotinsäure zur Bildung der pyridinhaltigen Codehydrase I und II benötigt werden kann (Franke (126)). Es ist auch möglich, daß die Ölsäure im Redoxgeschehen der Zelle vermittels der Hydrierung seiner Äthylenbindung im Sinne der Versuche von F. G. Fischer (124) und Mitarbeiter eine wichtige Rolle spielen kann. Die ungesättigten Fettsäuren, besonders die Ölsäure, besitzen eine sehr wichtige Eigenschaft, in passenden Konzentrationen die Entwicklung der Diphtheriebakterien elektiv zu hemmen (Hettche (131)). Dieses Merkmal wurde von Engering (200) zur Herstellung seiner selektiven Oleat-Platte ausgenützt, die die meisten Diphtheriestämme in ihrem Wachstum hemmt, während die Pseudodiphtheriebakterien sich gut darauf entwickeln können. Die antibiotische Wirksamkeit (in vitro) von B. mensentericus vulgatus (Hettche und Weber (133)), Weiland (162)), der Pyozanase (Wagner (161)), Hettche (132)), so- wie einiger vergrünender Mundstreptokoken (Sioelzl (134)), den Diphtheriebakterien gegenüber beruht auf ihrem Gehalt an gewissen ungesättigten Lipoiden und Fettsäuren. Larson (137) hat gefunden, daß das Abszesseiter 1—4 Dlm des Diphtherietoxins zu neutralisieren vermag. Nach der Extraktion des getrockneten Eiters mit Äther und Alkohol verliert der erhaltene Rückstand seine entgiftende Kraft. Die nach der Ver- seifung des Extrakts erhaltenen Fettsäuren, die zum größten Teil der ölsäurereihe angehören, sind ebenso wirksam wie die Extrakte selbst. Lezithin, Cholesterin und Kefalin wirken ebenfalls detoxifizierend. Es wird vermutet, daß die Fettsäuren und ihre Derivate auch in vivo bei der Abwehr der Diphtherieintoxikation eine wichtige Rolle spielen können. Das ß -Alanin soll der Synthese des Wuchsstofis-Panthothensäure dienen. Direkt nachgewiesen ist das nicht; weitere Forschungen in dieser Richtung sind mehr als er- wünscht, wegen der großen Aussichten, die sie bei der Herstellung von hochwertigen diagnostischen und industriellen, der Toxingewinnung dienenden, Nährböden eröffnen sollen. Als ein provisorisches Zwischenresultat veröffentlichte Mueller 1838 (152) das Re- zept eines halbsynthetischen Nährbodens, auf dem der Torontoer Stamm Park- Williams Nr. 8—60 Lf Toxin pro ccm und 1 Dlm in 0,0005 ccm lieferte. Er besteht aus: I: Einem Salzsäurehydrolysat des Kaseins, das eisenfrei und 10 % Eiweiß äquivalent ist; II: einer wässerigen Lösung von MgSÖ4 . 7 H2O = 22,5%, ß-Alanin = 0,115%; Nikotinsäure = 0,115%; Pimelinsäure = 7,50 mg %; CUSO4 .5 H2O = 0,05%; ZnSÖ4 . 7 H2Ö = 0,04%; MnCl2 = 0,015 %; III: 20% schwach salzsaurer Zystinlösung; IV: 1 % Lösung von FeSÖ4 . 7 H2Ö in 1 % HCl; V: 50 % Lösung von Maltose, die 0,5 % CaClo . 2 H2Ö enthält. 175 ccm Kaseinhydrolysats werden mit 825 ccm Wasser und je 2 ccm der Lösung II und III und einer empirisch festzustellenden Eisenmenge vermischt. Nach dem Steri- lisieren werden 3,5 ccm Lösung V pro 100 ccm Nährboden zugesetzt. Alle Lösungen sind lange haltbar. t Die Gruppe englischer Forscher aus Leeds (W. C. Evans, F. C. Happold, W. R. C. Handley, F. W. Chattaway u. a.), die 1931 zuerst eine praktisch brauchbare Einteilung der Dyphtheriebakterien in die Typen Gravis, Intermedins und Mitis durchführten, schenkte der Frage des Verwendungsstoffwechsels einzelner Typen in synthetischen Medien ihre besondere Aufmerksamkeit. Die Hauptursache dafür bildete die Erkennt- 25 uis, daß es bis dahin (1939) noch nicht gelungen war, von Gravis-Stämmen in syntheti- schen Kulturen ein wirksames Toxin zu erhalten. Das steht im Gegensatz zu der großen pathogenetischen Bedeutung dieses Typs. Es wurde versucht, die erhöhte Patho- genität dieser Keime durch ihre höhere invasive Kraft oder durch ihre Fähigkeit das Toxin nur in vivo, nicht aber in vitro zu erzeugen, zu erklären. Die meisten untersuchten Gravis- und Mitisstämme (123) gingen in der Muellerschen synthetischen Lösung an, während die Züchtung von Intermediumstämmen nur nach einigen Abänderungen in dem Substrat gelang. Es wurde eine neue Salzmischung, die 50 mal mehr Mineralbestandteile als die Mueller-Lösung, sowie das käufliche, nicht gereinigte Kasein enthielt, zur Herstellung des für Intermedius geeigneten Mediums verwendet. Das Wachstum der Gravisstämme in der Muellerschen Lösung wurde besonders nach dem Zusatz von Panthothensäure wesentlich gefördert. Diese Säure konnte auch die aktivierende Wirkung der Leber- und anderer Gewebsextrakte fast völlig ersetzen. Auch in dem Filtrat der Diphtheriebakterienkulturen auf dem Aminossäurennähr- boden nach Evans u. a. wurde ein aktiver Wachstumsfaktor nachgewiesen, wobei es sich offenbar ebenfalls um Panthothensäure handelt. In bestimmten Nährböden können die Diphtheriebakterien gewisse Substanzen selbst synthetisieren, deren Wirkung den vom Aneurin, Riboflavin, Codehydrasen I und II, sowie von der Panthothensäure ausgeübten Wirkungen ähnlich war. Ein neuer Wuchsfaktor wurde aus den Rückständen des ersten und zweiten Glaxo- Leberflltrats dargestellt (115), welches das Wachstum von Gravis und Intermedius- Stämmen im synthetischen Medium fördert. Er ist als vom Biotin verschieden gefun- den. Nach den ersten chromatographischen Analysen wurde vermutet, daß es sich hier- bei um die p-Aminobenzoesäure handelt. In neuester Zeit (116) erscheint dieser neue Faktor als in vielen Hinsichten von der für Lactobacillus casei wichtigen p-Aminobenzolsäure verschieden. Er ist im Äthanol und anderen organischen Lösungsmitteln unlöslich. Nach 15 Minuten Kochen mit Ninhydrin in einer Vs gesättigten Kaliumbiphosphatlösung wird er zerstört. Er wird nicht durch p-Kresol gelöst. Außerdem ist er durch Siltaersalze bei pH = 7 nicht ausfällbar. Seine wirkliche Natur bleibt zur Zeit ungeklärt. Er ist relativ säurestabil, aber stark alkaliempflndlich. H2(D2 und Nitrite, sowie die Methylenisierung bzw. Acetylierung zerstören ihn ebenfalls. Er ist an der Noritkohle adsorbierbar. Er wirkt wachstumsfördernd auf Diphtheriebakterien noch in einer Konzentration von 5y0/„, die optimale Konzentration ist von ca. 500 y °/o (Chattaway und Mitarb. (117)). Daß der p-Aminobenzoesäure doch eine wichtige Rolle im Leben der Diphtherie- bakterien zukommen muß, ersieht man deutlich aus der Tatsache der wachstumshem- menden Wirkung von Sulfonamiden auf diese Keime. R. Kuhn (136), F. Möller u. a. haben gezeigt, daß die p-Aminobenzoesäure das wirksamste Vitamin ist, das wir kennen, das noch in einer Verdünnung von 1 ; 10 11 auf das Wachstum einiger Mikroben för- dernd wirkt. Seine Wirksamkeit tritt besonders deutlich bei seiner Konkurrenz mit ähnlich gebauten Sulfonamiden zutage. Die Sulfonamide verdrängen die p-Amino- benzoesäure, infolge der Ähnlichkeit ihrer chemischen Strukturen, von den lebens- wichtigen Wirkzentren der Bakterienzellen und üben dadurch ihre wachstumshem- mende Wirkung aus. NH2 . CgH4 . COOH = p-Aminobenzoesäure = Wuchsstoff NH2 • CßH4 . SO3H = p-Sulfanilsäure = Hemmstoff. F. Nitti, M. Philippe und D. Bovet (155) fanden, daß das p-Aminophenylsulfamid (Präparat 1162 F) in vitro eine verzögernde Wirkung auf das Wachstum der Diph- theriebakterien ausübt, aber die Toxinbiidung nicht verhindert. Nach einer Reihe von Passagen gewöhnen sich die Diphtheriebakterien an das Sulfonamid, gleichzeitig wer- den sie auch den anderen Schwefelverbindungen, z. B. den Sulfonen, gegenüber un- empfindlich. 26 Ähnliches beobachteten auch A. Rouslacrois, E. Schäfer und H, Messer (157), die bei den in sulfopyridinhaltiger Bouillon gezüchteten Diphtheriebakterien eine vermin- derte Virulenz für das Meerschweinchen sahen. Wurde das Sulfonamid erst nach 24—72 Stunden der Bebrütung der Kultur zugesetzt, blieb die Wirkung aus. Auch die perorale bzw. subkutane Behandlung der mit Diphtherietaakterien infizierten Meer- schweinchen mit Sulfonamid erhielt die Tiere mehrere Tage am Leben, während die unbehandelten Kontrollen unablässig starben. H. Burton, J. W., T. S. MacLeod und ;\. Mayr-Harting (114) fanden, daß das Sulfanilamid und p-Hydroxylaminosulfonamid auf Diphtheriebakterien stark wachstumshemmend wirken, während das p-Nitro- benzolsulfonamid viel schwächer ist. Diese Beobachtung wurde als Unterstützung ihrer Auffassung über die Bedeutung von intermediär auftretenden Reduktionsstufen von Sulfonamiden für ihre Wirksamkeit auf die pathogenen Bakterien in vivo herangezogen. H. Hompesch (237) beobachtete, daß alle drei Diphtheriebakterientypen in ihrem Wachstum in Rindfleischbouillon durch verschiedene Sulfonamide gehemmt wurden. Besonders starke Wirkung hatten Globucid und Albucid, etwas schwächere — Pronto- sil solubile, gar keine — Tibatin. Der Typ Intermedius erwies sich als den Sulfon- amiden gegenüber viel empfindlicher als die Typen Gravis und Mitis. Die wachstums- hemmende Wirkung der geprüften Präparate wurde durch Zusatz von p-Amino- benzoesäure regelmäßig aufgehoben. O. Stickl und K. Gärtner (159) beobachteten, daß bei Meerschweinchen und Kanin- chen, die mit einer zweifachen sicheren tödlichen Dosis des Diphtherietoxins vergiftet waren, eine Nachbehandlung mit verschiedenen Sulfonamiden bei einem Teil der Tiere lebensrettend wirkt. Die Autoren glauben, daß es sich dabei um eine richtige Neutrali- sation des Toxins durch Sulfonamide in vivo handeln muß, weil die verwendeten Bakterienkulturflltrate vollkommen keimfrei waren, so daß eine Vermehrungshem- mung der Keime in vivo dabei nicht in Frage kommt. Man muß dabei aber mit der Möglichkeit einer unspezifischen Beeinflussung der Abwehrvorrichtungen (etwa des RES des tierischen Organismus) durch Sulfonamide rechnen. Die Diphtheriebakterienstämme, die von den mit Globucid (dreimal täglich je zwei Tabletten) behandelten Diphtheriekranken isoliert waren, sind durch ihre verminderte Vitalität in künstlichen Nährböden ausgezeichnet. Gute therapeutische Erfolge bei maligner Diphtherie wurden mit 7—8 gr Globucid (intravenoes) während zwei bis drei Tagen, begleitet durch Rachenspülung mit 3—5 °/oiger Globucidlösung erzielt (Harmsen und Siegler (130)). Wenn wir, zusammenfassend, eine Liste der bisher entdeckten Wachstumsstoffe der Diphtheriebakterien aufstellen wollen, müssen wir zwischen den unentbehrlichen und wachstumsfördernden Faktoren unterscheiden. Zu der ersten Gruppe gehören; die dibasischen Aminosäuren (Glutominsäure, As- paraginsäure) und ihre Amide, Zystin und Phosphate. Mit diesen Stoffen allein können einige Stämme zur Entwicklung kommen. Meisten- teils benötigen aber die Diphtheriebakterien zu ihrem ergiebigen Wachstum noch: Aminosäuren: Glykokoll, dl-Valin, dl-Methionin, dl-Phenylalanin, 1-Tryptophan und 1-Histidin. Nach den Ergebnissen von L. C. Banguesg (106) verwertet der Stamm Ho-Yu außer dem 1-Tryptophan auch seine d-Form. ß-Alanin, Panthothensäure; Primelinsäure, Ölsäure, p-Aminobenzoesäure. C-Quellen: d-Laktat, Äthanol, Glyzerin, Zucker (Glukose, Maltose, Fruktose); Ionen: K, Na, Ca, Mg, Fe, Cu, Mn, Zn und Sulfate und Chloride. Aber auch in Anwesenheit aller dieser Stoffe ist der Nährboden nicht für alle Stämme und nicht unter beliebigen Züchtungsbedingungen anwendbar, noch ist er ge- eignet, eine optimale Toxinbildung bei allen Stämmen einzuleiten. Es bestehen große individuelle Unterschiede zwischen einzelnen Stämmen hinsichtlich ihrer Ernährungs- bedürfnisse. 27 Neben den oben zitierten wachstumsfördernden Substanzen gibt es noch einige, die das Wachstum der Diphtheriebakterien mehr oder weniger spezifisch hemmen können. V. Glass (128, 129) beobachtete, daß das durch Hitze, Säuren oder Alkalien koagulierte Blut auch das verdaute Blut, sowie Haematin das Wachstum der Diph- theriebakterien, besonders des Typs Mitis, hemmen. Diese Wirkung ist an die An- wesenheit von Eisen in den Blutprodukten gebunden, da sie bei anaerober Bebrütung, sowie beim Zusatz von Natriumsulfit oder KCN aufgehoben wird, und da das Haema- toporphyrin keine Wachstumshemmung ausübt. Diese Wirkung ist aber nicht mit der Peroxydaseaktivität des Haematins verknüpft, weil das Verhältnis der minimalen wachstumshemmenden Dosis des Haematins 1 : 50 beträgt. Es handelt sich wahrschein- lich um eine Störung der Atmungsfermente der Diphtheriebakterien. Es war lange Zeit nicht gelungen die Diphtheriebakterien in einer synthetischen Lösung anaerob zu züchten. 1937 berichtete O. Ehrismann (121) über erste erfolgreiche Versuche in dieser Richtung. Er hat für die anaerobe Kultivierung von einigen Diph- theriestämmen eine synthetische Lösung folgender Zusammensetzung benutzt: NaCl 0,5 gr KH2PO4 0,05 gr K2HP04 0,15 gr MgS04 0,005 gr Na-asparaginat 0,125 gr Zystin (Zystein) 0,0125 gr Na-succinat 0,5 gr Na-fumarat . . . . 0,5 gr Dest. Wasser .... ad 100,0 gr pH = 7,6. In dieser Lösung spielt Na-succinat die Rolle eines Wasserstoff-donators, Na-fuma- rat die eines Wasserstoffacceptors. Sie können durch Brenztraubensäure oder ein Aminosäurengemisch nach Stickland oder durch NaNCL ersetzt werden. Zu dieser Grundlösung wurden als C-Quellen-Glukose oder Fruktose, Glyzerin, Maltose, Na- laktat und Na-malat zwecks Wachstumsverbesserung zugesetzt. Die in solchem Nährboden anaerob gezüchteten Diphtherie-Stämme ließen schon nach drei bis vier Passagen das Auftreten von atypischen, wahrscheinlich degenera- tiven Kugelformen der Bakterienzellen erkennen, die, auf einen passenden Nähr- boden übertragen, sich wieder zur normalen Zellform zurückverwandelten. Eine Toxinbildung konnte unter den obigen Bedingungen nicht erzielt werden. Die Viru- lenz der Keime wurde abgeschwächt. Das invasive Vermögen im tierischen Organis- mus blieb dagegen unverändert. Am besten entwickelten sich in solchem Medium Mitiskeime, an zweiter Stelle Gravis-Stämme. Intermedius wuchs in diesem Substrat überhaupt nicht. Es wurde dabei die interessante Beobachtung gemacht, daß in dieser synthetischen Lösung weder Ascorbinsäure, noch die Ferro-Ionen einen Einfluß auf das Bakterien- wachstum ausübten. Auch (122) unter aeroben Bedingungen auf gewöhnlichen Nähr- böden veränderte die Ascorbinsäure das Wachstum der Diphtheriebakterien nicht, während die Pseudodiphtheriebakterien dadurch in ihrem Wachstum stark gehemmt wurden. Diese Beobachtungen wurden durch das verhältnismäßig niedrige Normal- Redoxpotential der Ascorbinsäure (Eh = —0,070 Volt bei pH = 7) erklärt, das mit dem Wachstum der streng aeroben Pseudodiphtheriebakterien nicht verträglich sein soll. Die fakultativ anaeroben Diphtheriekeime können dagegen bei diesen Redoxver- verhältnissen noch ganz gut gedeihen. Die Frage der Beeinflussung einzelner Partial- funktionen der Mikroorganismen durch die Redoxsubstanzen befindet sich noch in den Anfängen ihrer Entwicklung, so daß zur Zeit keine umfassende Erklärung der auf diesem Gebiete gesammelten Beobachtungen möglich ist. Nach J. Gordon und J. C. Knox (127) wirken die wässrigen bei 65 °/o ohne Luft- abschluß hergestellten Auszüge aus den Rinder-Nebennieren hemmend auf das Wachs- tum der Diphtheriebakterien. 28 2. Energieliefernde Vorgänge. Vom energetischen Standpunkt aus betrachtet sind alle Lebewesen solche Systeme, in denen die irreversiblen Energieentwertungsprozesse, die überall in der Natur ge- mäß dem zweiten Prinzip der Thermodynamik verlaufen, durch sinngemäße Zwischen- schaltung von fast umkehrbar arbeitenden Teilvorgängen so gestaltet sind, daß der Energiestrom je nach den vorliegenden Bedürfnissen in der gewünschten Richtung fast augenblicklich gelenkt werden kann. Der Abbau wird in Synthese übergeleitet, Dissimilation in Assimilation und umgekehrt. Die beim Abbau von energiereicheren Verbindungen gewonnenen Beträge an freier Energie werden entweder den spezifischen Effektoren, z. B. den Muskelfasern, zuge- führt oder zum Aufbau anderer lebenswichtiger Substanzen oder Mikrostrukturen ver- wendet. Diese letzteren besitzen wiederum einen höheren Energieinhalt als ihre Aus- gangsprodukte. Als Beispiel eines solchen Vorganges sei die Pasteur-Mayerhofsche Reaktion genannt, bei der auf Kosten des Abbaus einer Anzahl von Milchsäuremole- külen, eine andere kleinere Anzahl von ihnen zum Glykogen resynthetisiert wird. Dieser ständige Energiestrom läuft in beiden Richtungen — Abbau und Synthese — meistenteils über mehrere Zwischenstufen, wobei als eigentliche Energieüberträger bei den bisher bekanntgewordenen Vorgängen Wasserstoffatome (oder Wasserstoffionen- Protone) und Elektrone fungieren. Dabei sind besonders zwei wichtige Spezialfälle gut zu unterscheiden. Bei den oxybiotischen Prozessen (Atmung in engerem Sinne) gelangen die H-Atome über eine Reihe von Pyridin-, Flavin- und Haeminzwischenfermenten in eine Berührung mit dem Sauerstoff, der seinerseits unter Beteiligung von eisenhaltigen Fermenten auf diese Begegnung mit Wasserstoff vorbereitet wird. Es entsteht dabei H2G2, dessen schädliche Wirkung durch die ubiquitär verbreitete Katalase vernichtet wird. Bei den anoxybiotischen Lebensvorgängen (Gärungen) treten an Stelle des Sauer- stoffs verschiedene andere Substanzen als H-acceptoren auf. Das sind meistens ver- schiedene wasserstoffärmere Zwischenprodukte des Zellstoffwechsels selbst. Bei diesen Prozessen pendeln also die Wasserstoff atome innerhalb des Kreislaufs des inter- mediären Stoffwechsels von gewissen Substanzen zu den anderen. Auch hierbei spielen die pyridinhaltigen Dehydrasen und gewisse flavinhaltige Zwischenfermente eine aus- schlaggebende Rolle. Die Diphtherie- und Pseudodiphtheriebakterien können die verschiedenartigsten Moleküle und Atomgruppen als H-Acceptoren benutzen, und zwar den molekularen Sauerstoff, verschiedene Farbstoffe aus der Gruppe der Redoxindikatoren, Nitrat-, Tellurit-, Selenit-, Sulfat-Anionen, mannigfaltige Produkte des intermediären Kohle- hydrat- und Eiweißstoffwechsels u. a. Dabei übernehmen die Rolle der H-Donatoren die Kohlehydrate selbst, sowie ihre Abbauprodukte, ferner gewisse Aminosäuren. Glyzerin, Lezithin u. a. Bei den meisten dieser oxydoreduktiven Vorgänge ist die Be- teiligung von Zystin nachgewiesen, in der letzten Zeit auch der Ascorbinsäure wahr- scheinlich gemacht. Die Anwesenheit des Sauerstoffs ist für das Wachstum der Diphtheriebakterien, wie wir früher gesehen haben, nicht unbedingt notwendig. Sie wirkt aber auf das Wachstum begünstigend. Die Diphtheriebakterien können sich auch in einer H2-, N2-, CG2-Atmosphäre entwickeln (R. Schröder) (183). W, N. Plastridge und L. F. Rettger (180) sahen, daß der Zusatz von C02 zu der Kulturgefäßluft ein besseres Anfangs- wachstum ermöglicht. Bei den kohlehydratfreien Nährböden steigt mit der Zeit das pH an; C02 wirkt dieser Alkalisierung des Nährbodens entgegen. Dadurch wird auch das gebildete Toxin vor der Zerstörung geschützt. Eine zu große CG2-Menge ist un- günstig, da sie den Nährboden zu stark ansäuert. Als optimal wurde bei einem Sauer- stoffgehalt von 15—20 °/o, die CG2-Konzentration 5—10 °/o gefunden. Wenn der Sauer- 29 stoffgehalt auf 1,5 % erniedrigt wird bei gleichzeitiger C02-Vermehrung, kommt es zu einer Verlangsamung des Wachstums und der Toxinbildung. P. Dahr (166) beobachtete, daß alle untersuchten Vertreter der Corynebakterien- gruppe in einer Leuchtgas- oder H2-Atmosphäre gleich gut gedeihen. Die Experimente über die Wirkung der mit C02 stark angereicherten Atmosphäre auf das Wachstum der Corynebakterien berurteilt Dahr derart, daß alle geprüfte Diphtheriebakterien unter einer morphologischen Annäherung an die Pseudodiphtheriebakterien sich in CO2 züchten lassen. Bei C. hoffmanii wurde ein Wachstum in der C02-haltigen Luft nur bei vier von 134 Stämmen beobachtet. Die anderen „Diphtheroiden“ (darunter auch die saccharosespaltenden Paradiphtheriebakterien) verhalten sich dem Kohlen- dioxyd gegenüber verschieden und sind zum Teil C02-resistent, teilweise aber emp- findlich. Für die Toxinbildung ist der Sauerstoff unentbehrlich. Noch Roux und Martin beobachteten eine deutliche Steigerung der Toxinausbeute bei einer ausreichenden Durchlüftung der Kulturflüssigkeit. Lorentz (101) züchtete die Diphtheriebakterien in einer 02-Atmosphäre und beobachtete dabei, daß bei gleichzeitiger Verkleinerung der Kolonien die Virulenz der Diphtheriebakterien anstieg. Schneider (181) hat schon nach einer Passage unter anaeroben Bedingungen eine deutliche Virulenzverminderung der Diphtheriebakterien festgestellt. Beck (164) konnte aber keine Parallelität zwischen der Virulenz der Diphtheriebakterien Und dem par- tialen Druck des Sauerstoffs in dem Versuchsgefäß feststellen. Bei solchen unphysio- logischen Wachstumsbedingungen wird öfter eine Annäherung des morphologischen Habitus der Diphtheriebakterien an den der Pseudodiphtheriebakterien bemerkt (Pol- körnchenschwund, parallele Lagerung, äußere Struktur der einzelnen Zellen). Die Pseudodiphtheriebakterien sind durch ihre streng aerobe Lebensweise ausge- zeichnet, was auch in ihren anderen Lebensäußerungen zum Ausdruck kommt. Bei den aeroben axidativen Prozessen benötigen die Diphtheriebakterien in unge- waschenem Zustand (Durchschnitt der ersten zwei Stunden) 3,36 mm3 02 pro 1.10S Keime und eine Stunde; dreimal mit einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung ge- waschene — ca 0,83 mm3, d. h. ungefähr lU des ersten Werts (Ehrismann (167)). Wenn man den Anteil der vermehrungsfähigen Keime an der gesamten Keimzahl zu 1—10 °/o schätzt, ergeben sich 10—lOOmal größere Werte für die Sauerstoffzehrung der leben- digen Bakterien, was recht unwahrscheinlich ist und annehmen läßt, daß die Atmungs- prozesse auch bei den abgestorbenen Keimen weiterbestehen können. Die beobachtete Verminderung des 02-Verbrauchs nach dem Auswaschen der Keimsuspensioneh ist auf die Ausschwemmung der leichtlöslichen H-Donatoren und der leichtdissoziirenden Kofermente (Codehydrasen) zurückzuführen, da nach der Wiederzugabe der Wasch- wässer der Sauerstoffverbrauch wieder ansteigt. Die Höhe der Sauerstoffzehrung nach der Zugabe von Waschwässern und entsprechenden H-Donatoren (z. B. des Laktats) ist höher als die Summe der Atmungswerte der gewaschenen Keime in Anwesenheit von Waschwässern und des Laktats allein. Als H-Donatoren wurden dabei die folgenden Substanzen als geeignet gefunden; einige Aminosäuren, die von den Diphtheriebakterien als C- und N-Quellen verwendet werden, dann von den Zuckerarten: Glukose, Fruktose und Maltose, ebenso wie ge- wisse Zuckerabbauprodukte: Milchsäure, Brenztraubensäure, Bernsteinsäure, endlich Glyzerin und Lezithin. Zystin wirkt in so geringen Konzentrationen im Sinne einer Steigerung des 02-Verbrauchs, daß ihm wahrscheinlich eher die Rolle eines Atmungs- katalysators als die eines H-Donators zuzuschreiben ist. Bemerkenswert ist dabei der Befund, daß das pH-Optimum für die Dehydrierung der zelleigenen H-Donatoren viel niedriger ist (pH = 6), als das Optimum für die Dehydrierung der zugesetzten chemisch definierten Substanzen (pH = 7,4—7,6). Im Laufe des Keimvermehrungsvorganges wächst der Sauerstoffverbrauch ganz be- trächtlich an und erreicht sein Maximum nach 8—10 Stunden, um nachher wieder ab- zunehmen, wahrscheinlich infolge des Überwiegens des Absterbe- und Autolyse- 30 Prozesses in der Kultur. Insgesamt ist zum Aufbau der Masse von ca. 1 • IO9 Keimen die Menge von ca. 250—550 mm3 Sauerstoff in einer synthetischen Nährlösung, von ca. 650 mm3 in Bouillon notwendig. Fujita und Kodama (171) bestimmten die wichtigsten Stolfwechselquotienten bei verschiedenen pathogenen Mikroben und fanden bei den Diphtheriebakterien einen mäßig großen Atmungsquotient, d. h. die verbrauchte Sauerstoffmenge in mm3 pro 1 Stunde und 1 mgr Trockengewicht. Auf verschiedenen Nährböden schwankten deren Werte erheblich: gewöhnlicher Agar = —66,4; Bouillon = 24,8; Glukoseagar = —40,0; Löfflerserum = —55,2; Blutagar (aerob gezüchtet) = —67,0; Blutagar (anaerob gezüchtet = —136,0. Audi die anderen Stoffwechselquotienten — für aerobe und für anaerobe Gärung — wiesen deutliche Abhängigkeit von dem verwendeten Substrat auf. Im Vergleich mit anderen gleichzeitig untersuchten pathogenen Bakterien nehmen die Diphtheriebakterien im Hinblick auf die geprüften Eigenschaften mit Ausnahme der Kataiaseaktivität eine mittlere Stelle ein: Tabelle Quotient Minimum Maximum Dipththerie- bakterien Atmung = QO2 —8 Meningococcuss —172 Ruhr Ohara-Mita —68 02 Aerobe Gärung = Qg 0 Meningococcuss —221 Pneumococcus I —36 n2 Anaerobe Gärung = Qg 0 Meningococcuss —308 Pneumococcus I —99 Katalase Aktivität = QKat 0 Ruhr Shiga —9000 Diphtherie —9000 In weiteren Versuchen untersuchten Fujita und Kodama (172) den Einfluß verschie- dener Faktoren auf die Atmung und Gärung der Diphtheriebakterien. Sie fanden, daß- 1. Mit dem Altern der Kultur auf Blutagar die Atmungsgröße allmählich auf Null ab- sinkt, und zwar in den ersten zwei Tagen langsam, und dann in weiteren 3—4 Tagen schneller. Im Eisschrank geht die Abnahme langsamer. Die Gärung der Glukose ver- hält sich ähnlich. 2. Optimales pH liegt für die Atmung und Glukosegärung zwischen 7,1 und 7,7. 3. Die Atmung nimmt mit der Temperatur bedeutend zu, und zwar umso mehr, je niedriger die Anfangstemperatur ist. 4. Von den Zuckern wird am leichtesten die Glukose veratmet und vergoren; Laktose, Saccharose und Pentosen sehr schwach. 5. Von den organischen Säuren und Alkoholen veratmen die Diphtheriebakterien nur Brenztraubensäure, Milchsäure, Glyzerin und Glyzerinphosphorsäure vollkommen, Essigsäure, Bernsteinsäure und Äpfelsäure in viel kleinerem Ausmaß. Vergoren wird praktisch nur die Brenztraubensäure, und zwar unter Decarboxylierung. 6. Von den Aminosäuren ist die Veratmung des Asparagins und der Glutaminsäure am größten. Auch das Zystein wird veratmet. Es verstärkt auch die Veratmung anderer Substanzen in der synthetischen Lösung. 7. Die Atmung und Gärung sind bei den Diphtherie- bakterien durch Monojodessigsäure schon in einer Konzentration von 1 * KT5 mol bis zu 50 °/o gehemmt. Die Fluoride hemmen die Glukosevergärung bei den Diphtherie- bakterien nicht. 31 Von anderen Forschern untersuchten Silberstein und Rappaport (184) den respira- torischen Stoffwechsel bei den Diphtherie- und Xerosebakterien und fanden dabei deutliche und charakteristische Unterschiede. Schapiro (182) hat die Atmung der Diph- theriebakterien in jungen Kulturen in einer Warburgschen Apparatur verfolgt und fand dabei, daß die Atmungsgröße für einzelne Stämme ziemlich konstant ist. Beim Altern der Kulturen sinkt die Atmung in 2—3 Tagen auf die Hälfte, wahrscheinlich unter dem Einfluß der angefallenen Stoffwechselprodukte. Typ Gravis atmet ca. 2,5 bis dreimal stärker als Mitis. Stamm Park-Williams Nr. 8 atmet 5—5,5 mal stärker als gewöhnlicher Mitis. Als H-Acceptor können die Diphtheriebakterien (ebenso die Pseudodiphtheriebak- terien) auch die Nitrat-Ionen verwenden (Ehrismann (167, 168)), die dabei zu Nitriten reduziert werden. Diese Reaktion spielt sich mit einer meßbaren Geschwindigkeit nur unter dem Ausschluß des Sauerstoffs, bei pH kleiner als 6,0 ab und wird durch das Zystin deutlich verstärkt. Die begünstigende Wirkung des Zystins hat aber ein anderes pH-Optimum = 7,6. Die Reaktion ist ziemlich eng spezifisch im Hinblick auf die dabei beteiligten H-Donatoren: nur Alanin und Asparagin werden dabei in Anwesenheit des Zystins, von den stickstoffreien Substanzen aber nur Laktat dehydriert. Die Nitratreduktion wird durch HCN und CO gehemmt, was auf eine Beteiligung der eisenhaltigen Katalysatoren hinweist. Bei den streng aeroben Pseudodiphtherie- bakterien ist die Fähigkeit, Nitrate zu reduzieren, in stärkerem Maße ausgebildet. Die reduktionsfördernde Wirkung des Zystins hat dagegen nur bei Diphtherie- und nicht bei Pseudodiphtheriebakterien Gültigkeit. Einen weiteren H-Acceptor bei der Atmung der Diphtherie- und Pseudodiphtherie- bakterien hat Ehrismann (169) im Pyozyanin gefunden. Er untersuchte die Pyozyanin- hydrierung einerseits durch Azetonextrakte aus verschiedenen Bakterienarten, ande- rerseits durch ungewaschene Suspensionen der untersuchten Keime. Dabei ist es ihm gelungen mit Sicherheit festzustellen, daß die Azetonextrakte über eine viel engere H-Donatorenspezifltät verfügen und praktisch nur Laktat als H-Donator verwenden. In Versuchen nach dem Verfahren von Thunberg zeigen die ungewaschenen Bakterien unter anaeroben Bedingungen eine viel breitere H-Donatorenspezifität als die Azeton- extrakte. Interessant ist dabei zu beobachten, daß die beiden zentralen Körper in dem Zellstoffwechsel — Brenztraubensäure und Bernsteinsäure — von den intakten Diph- theriebakterien nur mit O2 als H-Acceptor, dehydriert werden. Bei Verwendung von Nitraten, als H-Acceptor, wird keine von diesen Säuren, in Anwesenheit von Methylenblau und Pyozyanin nur die Bernsteinsäure dehydriert. Das Pyozyanin mit seinem Redox-Normalpotential = —0,034 Volt liegt in der Nähe des Neutralitäts- punkts der Redoxskala (E = + 0,000 Volt) und des Normalpotentials des Methylen- blau (Eh = + 0,011 Volt) (W. Kollath (178)). HCN hemmt die 02-Atmung mit und ohne Pyozyanins was darauf hindeutet, daß das Pyozyanin hier in den H-Transport irgendwie nebengeschaltet ist. In einer weiteren Arbeit untersuchte Ehrismann (170) die oxydoreduktiven Lei- stungen der Diphtheriebakterien mit Hilfe verschiedener Farbstoffe aus der Gruppe der Redoxindikatoren nach Clark, und zwar in Anwesenheit von nur zelleigenen H-Donatoren, sowie nach dem Zusatz von Laktat oder Succinat. Dabei fiel ihm eine gewisse Parallelität zwischen der Reduktionsgeschwindigkeit und der Lage des Re- duktionspotentials des betreffenden Indikators in der Redoxskala auf. Am schnellsten wurden diejenigen Indikatoren reduziert, deren Potentiale in der Nähe des Neutrali- tätspunkts der Redoxskala oder auf ihrer positiven Seite liegen. Es wurden aber auch bei einigen Farbstoffen Abweichungen beobachtet, die einerseits mit ihrer chemischen Konstitution (besonders bei Indigosulfonaten) im Zusammenhang stehen, andererseits aber auf ihre ungenügende Wasserlöslichkeit zurückzuführen sind. Die Reduktion der RedoxfarbStoffe erwies sich als völlig CN-unempflndlich und wenig spezifisch im Hin- blick auf die zutreffenden H-Donatoren. Zystin spielt auch bei diesen Prozessen die Rolle eines Katalysators, aber nur für Indikatoren mit genügend positivem Potential. 32 Tabelle II. Vergärung verschiedener Kohlehydrate durch Corynebakterien verschiedener Arten und Typen. Verfasser Grundsubstrat °/o des Zuckers Indikator Keimart bzw. Polysaccharride Di- Saccharide Mono -Saccharide Alkohole Bemerkungen Keimtyp St Gg Du R! M S L D F Gt Ms Rh X Ar Mn Sb Sz Gz In Gm Martin (1898) 224 Bouillon; Lackmus Di — — + — + + + 4- Knapp (1905) 218 Di Xerosis + + + + 4 4 Smith, G. (1907) 242 Di Xerosis + 4- + (+) • 4 (4) 4~ (44 4- 4- (4-) Rothe (1907) 238 Di Pseudo Xerosis • (44 (+) + (4-) + (+) Lubenau (1908) 221 Di und Di- phtheroide + + + + + + S, L und F erst nach 3—4 Tagen vergoren Neißer (1913) 227 Di Diphtheroide + (-) + (-) v. Riemsdijk (1915) 235 Peptonwasser pH-7,6; l°/o Lackmus Di virul Di avirul 9/io 5/5 Q/10 5/5 D wird ohne Gas- bildung vergoren Durand (1922) 199 Typ I Typ II Typ III—V + • + + 4- + • (+) 4- + 4- Bitter, Gundel, Sancho (1923) 191 Peptonwasser l°/o Chinablau Di + — + 4- Engering (1923) Thiel-Lösung; Lackmus Di Pseudo 2744 2744 Bei den Pseudo- tritt die Säuerung erst viel später als bei Di ein 200 Peptonwasser Lackmus Di Pseudo + 11, 47 (44 (4-) (+) + (4) 4 + (4-) 4- (4-) Pesch (1924) 230 Pepton wasser; l°/o; Lackmus Typ la Typ Ib Typ II Typ lila Typ Illb Typ IV (4) (4) • • + — 4 -j- 4 (4) + + e • (4-) • • • ■ ■ la-tiervirulente, Ib-tier- avirulente echte Di; II- Pseudo (Hoffmann); Hla- Para-Di; Illb-Diphthe- roide; IV-Xerosis. Xerosis kann in der Thiel- schen Lösung D und S spalten Hammerschmidt (1924) 205 Bouillon; 1%; Lackmus Haemoly- thische Nicht hae- molythische 4- (+) 53 haemolythische und 8 nicht haemolithische Stämme der echten Diphtheriebakterien Kliewe (1927) 217 Peptonwasser Thiel-Lösung; 1%; Di; typisch Minus A Minus B Minus- Plus A Minus- Plus B "f" ( + ) + (44 4- 4 4 (4) 4 4 + + 4 + + Di: typische Stämme — tiervirulent; Minusvari- anten A und B, sowie die Minusplusvariante A- avirulent; bei Minusplus- variante B-l Stamm ist virulent, 2 aber avirulent Lackmus Ps; typisch Minus A Minus B Minus C Minus D + + (4-) 4 (4-) 4 (-) (-) + + Alle Ps-Stämme sind für die Tiere nicht virulent. Minusvariante D- Xerosis Mannsheim (1930) 222 Pepton wasser; Lackmus Di 88 Stämme ö7/8 8 16/88 + 4- 4- 78/ss 16/S8 16 Stämme vom Typ S4, Mn 4 sind die Para-Di (9 aus inneren Organen) Ghio (1931) 202 Di Pseudo + + (44 (4-) + 4~ (+) 4- — 4- Maximum der Säurebil- dung bei Di: D- 2 Tage; F, Dn, M- 4 Tage; Gt, Gz- 12 Tage Anderson und Mit- arbeiter (1931/33) 188 Gravis Interm. Mitis + + + (+• 4 4 4 — 4 4 1 3osta, Troisier, Dauvergue (1918) 197a Koagul. Serum; Lackmus Di Pseudo B. entis communis • 4 + * + — + + + . + Brückner (1934) 194 Nutrose-NaCl- Lösung; l°/o; Lackmus Di Para-Di Pseudo 4 4 4 + 4- + 4- Whitley (1935) 249 Di-III St. 7/III 7/III + + — + Perry, Whitley u. Mitarb. (1936) 228 Bouillon Gravis Interm. Mitis 41/50 3/132 33/50 + 4 + — 4 4- 4 Preuner (1936) 233 Bouillon; 1 °/o; Lackmus Gravis Interm. Mitis Para-Di Diphtheroide Pigment- bildner Pseudo + 4 4 + 444 ++ H—h + (“ 444 (4) (4) Preuß (1936) 234 Ascitesagar 1 °/o; Trübung Di Pseudo 98,3<>/o 4 i,o«/o4 Mittag (1937) 225 Intexmedius — — + 4 Tellurit schwach reduzie- rende Stämme Henneberg u. Pels- Braunsche syn- thetische Lösung; 1 °/o; Phenolrot Chinablau; Indikatoren nach Michaelis; Elektrometrie Gravis Interm. Mitis Pseudo (Mensch) Pseudo (Kuh) + — + — 4 4 4 — — + + + 4- 4 + 4- 4~ 8888 (4-) 4 4 4- 4- (4) (4) i44 (4-) — (44 (4-) (- (4-) — Maximum der Säurebil- dung im Durchschnitt: a) in Braunscher Lösung: D, M, Gt- 1 Tg., F, Mn, St, Leusden (1937) 206 Autolysate der Bakterienzellen (Toluol); Lackmus Gravis Iterm. Mitis Pseudo (Mensch) Pseudo (Kuh) + — + (+) (4) (+) (4) (4) + 4 4 4 + 4 4 4 4 + — 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4- 4 4" 4 4 (44 (4) (4-* 44) (+) 4- X 4 + (-M (4) (4) (4-) (4-) 4 4- 4 4- 4- 4- 4 . + 4- — — Dn- 3 Tage, Gz- 4, Ar- 6 Tage; b) Autolysate; D, S-2; F, Gg, Ar, Sb, Sz, Mn, M-4; Rh, Rf-5 Tage Warnecke (1940) 247 Peptonwasser 1 °/o; Lackmus Gravis Interm. Mitis 4 + 4 4' 4 Hohn (1941) 210 Hottinger-Bouillon od. Trypsinpepton wasser; 1 °/o; Wasserblau Gravis Interm. Mitis Pseudo + — 4 4 4 Groß (1943) 203 Bouillon; 1 %) Gravis Para-Di 81/q4 V 47 Abkürzungen: Di—Diphtheriebakterien; Pseudo—Pseudodiphtheriebakterien; Para- Di—Paradiphtheriebakterien; bei Kliewe—Minus- u. Plus-Minus- und Plusvarianten; St—Stärke; Gg—Glykogen; Dn—Dextrin; Rf—Raffinose; M—Maltose; S—Saccharose; D—Laktose; D—Dextrose; F—Frukotose; Gt—Galaktose; Ms—Mannose; Rh—Rham- nose; X—Xylose; Ar—Arabinose; Mn—Mannit; Sb—Sorbit; Sz—Salizin; Gz—Glyzerin; In—Inulin; Gm—Glukosamin; +++, +++, + , — verschiedene Grade der Zucker- spaltung; ( + ) — Spaltung bei der Mehrzahl der geprüften Stämme; (—) — nur wenige Stämme vergären; keine Vergärung; .— nicht geprüft; 81/94 — von 94 geprüften Stämmen vergären 81. Durch diese Arbeiten von Ehrismann, Fujita und Kodama u. a. angeregt, unter- suchten wir zusammen mit Rueßbült (Tarnowski und Rueßbült (184)) die Hydrierung des Methylenblaus durch Diphtherie- und Pseudodiphtheriebakterien unter verschie- denen Versuchsbedingungen. Wir fanden, daß einzelne Diphtherie- und Pseudodiph- theriebakterien-Stämme große individuelle Unterschiede hinsichtlich der Geschwindig- keit der Entfärbung einer gewissen Menge Methylenblaus (2 • KT7 Mol. pro 1—2 • 10B Keime) in Anwesenheit von 1 • IO"4 Mol Na-Laktats als H-Donator aufweisen. Typ- bzw. artgebundene Gesetzmäßigkeiten wurden dabei nicht beobachtet. Bei den mit phos- phatgepufferter NaCl-Lösung gewaschenen Keimen trat eine HydrierungsVerlang- samung ein, die durch Zugabe von Waschwässern, sowie von sterilen Auszügen aus Löfflerserum, gewöhnlichem Nähragar und von einer sterilen Braunschen Nährflüssig- keit wieder verschwand. Diese Aktivität verschiedener Zusätze wurde als von der Individualität des Stammes, dem Züchtungsmedium und der Vorbehandlung des Stam- mes abhängig gefunden. Die Methylenblaureduktion gewaschener Diphtheriekeime wurde durch Vergiftung mit Phenylurethan und 1 : 2 : 4 : 6 Trichlorphenol in Mengen von 1 • KT7 bis 1 • KT6 Mol pro 1 • 109 Keime deutlich gehemmt, was durch Vergiftung der Apodehydrasen bzw. der Flavinzwischenfermente der Bakterien zu erklären versucht wurde. Das Verhalten der Methylenblaureduktion durch Diphtheriebakterien den KCN-Lösungen gegenüber hatte ein wechselndes Bild gezeigt. Gewisse KCN-Konzentrationen wirkten reduk- tionsfördernd, andere wieder (größere, sowie die kleinere) bei manchen Stämmen hemmend. Die zukünftige Forschung muß die einzelnen bei diesen Vorgängen teilnehmenden Fermente und deren Komplexe isolieren und in Modellversuchen ihr Zusammenwirken überprüfen. Nach L. F. Hewitt (176) sind die Reduktionsfähigkeiten der Diphtherie- kulturen bei reichlicher Sauerstoffzufuhr stärker als die der Streptokokkenkulturen entwickelt. In der Bakterienwachstumsphase steigt ihr Redoxpotential logarithmisch an, um sich später auf einem gewissen Niveau zu stabilisieren. Von einer hervorragenden Bedeutung für die bakteriologische Diphtheriediagnostik sind die Reduktionsvorgänge, die sich an den Tellurit-Ionen abspielen. Die Tellurite sind dabei irreversibel bis zum schwarzen elementaren Tellur reduziert, was als Schwärzung der Diphtheriekolonien auf einem festen Nährboden oder Bildung eines grau-schwarzen Niederschlags in den Nährflüssigkeiten sichtbar wird. Dieser Vorgang hat eine gewisse Ähnlichkeit mit der Nitratreduktion. Er wird durch die Anwesenheit des Zystins oder Zysteins deutlich verstärkt. Als erster hat Klett (177) die Reduktion der Selenite, Tellurite, Selenate, Sulfate und Phosphate durch verschiedene pathogene und saprophytische Bakterien untersucht und dabei festgestellt, daß die Fähigkeit, Selenite und Tellurite zu reduzieren, allen geprüften Bakterienarten zukommt. Die Geschwindigkeit der Reduktion, sowie die höchste mit dem Keimwachstum verträg- liche Salzkonzentration hängen von der Bakterienart, der chemischen Zusammen- setzung des Nährbodens, der Züchtungstemperatur usw. ab. Die Diphtheriebakterien zeichnen sich durch eine starke Hemmbarkeit und die ent- sprechend schwächere Reduktionsfähigkeit den Seleniten gegenüber aus. Über die Be- ziehungen der Diphtheriebakterien gegenüber Telluriten wird nichts mitgeteilt. Die Reduktion der Selenite und Tellurite findet in der Bakterienzelle selbst statt, die die Salze aus dem Nährboden aufspeichert und nach ihrer Reduktion in und zwischen den Zellen anlagert. In den festen Nährböden tritt keine Färbung in dem Substrat außer- halb des Kolonienbereichs auf, woraus Klett auf das Fehlen der reduzierenden Wir- kung der leicht diffusiblen Bakterienstoffwechselprodukte außerhalb der Zelle schließt. Interessant und für die bakteriologische Diagnostik wichtig ist der Umstand, daß die Bakterien wahrscheinlich die Selenit- bzw. Telluritreserven in der nächsten Kolonienumgebung bald erschöpfen, so daß bei weiterem Wachstum rings um die 33 älteren schwarz bzw. rot gefärbten zentralen Teile der Kolonien ein farbloser Ring aus jüngeren, Se- bzw. Te-freien Individuen entsteht. Selenate, Sulfate und Phosphate wurden von den geprüften Keimarten unverändert gelassen. Gosio (175) erweiterte und bestätigte in einer umfassenden Arbeit die Befunde von Klett, indem er die Anwendung der Tellurite als eines Indikators für die Entdeckung von bakteriellen Verunreinigungen der Heilseren und Vaccine vorschlug. Dabei wies er noch auf das Auftreten neben dem schwarzen elementaren Tellur von verschiedenen braunen und violetten Tellurkomplexverbindungen im Laufe ihrer Reduktion hin. Er unterstrich das Vorhandensein eines engen Zusammenhangs zwischen den bakteriellen Lebensleistungen und der Telluritreduktion. Weder abgetötete Kulturen noch zellfreie Kulturfiltrate vermögen Tellurite zu reduzieren. Die Diphtheriebakterien besitzen nur eine mäßig starke Fähigkeit zur Reduktion der Tellurite, die von mehreren pathogenen und saprophytischen Keimen übertroffen wird. Gloger (174) fand dagegen in seinen Versuchen, daß die Diphtherie- und Pseudo- diphtheriebakterien die Tellurite nicht reduzieren können (sic!), wenigstens nicht in der ersten Woche ihres Wachstums. Überhaupt weichen seine Befunde im Hinblick auf die Verbreitung dieser Eigenschaft bei Bakterien von denen Kletts und Gosios stark ab. Gloger beobachtete auch, daß die Telluritreduktion nur bei den Bakterien vor- kommt, die auf den zusagenden Nährböden H2S zu entwickeln vermögen. Die Ent- stehung des schwarzen Niederschlags führt er auf die Bildung von TeS und nur zum Teil von elementaren Te zurück. In unserer oben zitierten Arbeit (Tarnowski und Rueßbült, 1. c.) fanden wir, daß die Diphtherie- und Pseudodiphtheriekeime Tellurite und Selenite wahrscheinlich auf Kosten von wasserlöslichen zelleigenen H-Donatoren zu reduzieren vermögen. Nach dem Waschen der Keime trat eine Reduktionsverlangsamung ein. Die Reduktions- geschwindigkeit stand in keinem eindeutigen Zusammenhang mit der Tellurit- bzw. Selonitkonzentration. Jedenfalls ist mindestens eine Konzentration von 7—10T0~4mol% des K2Te03 bzw. Na2SeC>3 notwendig, um eine sichtbare Schwärzung bzw. Rötung der Lösung hervorrufen zu können. H. E. Morton und F. Anderson (179) glauben, mit Hilfe elektronenmikroskopischer Aufnahmen bei den auf dem tellurithaltigen Blutschokoladagar gezüchteten Diph- theriebakterien nicht nur die Polkörnchen, sondern auch gewisse danebenliegende nadelförmige schwarze Kristalle gesehen zu haben, denen sie eine Bedeutung bei der Telluritreduktion zuschreiben wollen. Besonders in den letzten Jahren machte die Erforschung der sog. Atmungskataly- satoren, d. h. der Körper, die bei dem Transport des Wasserstoffs innerhalb des intermediären Zellstoffwechsels von den dehydrierenden H-Donatoren auf die be- treffenden H-Acceptoren die Rolle der Übermittler spielen, recht ansehnliche Fort- schritte (siehe z. B. bei W. Franke (126)). Es bestehen viele Wege sowie viele vermit- telnde Zwischeninstanzen bei diesem Wasserstofftransport. Am nächsten zu dem H- Donator sind wahrscheinlich die Dehydrasen, deren prosthetische Gruppen (pyridin- haltige Nukleotide) den Wasserstoff vom Substrat übernehmen. Von Dehydrasen geht der Wasserstoff entweder auf ein anderes Produkt des Zellstoffwechsels über (Ver- gärung) oder wird über die zwischengeschalteten flavinhaltigen Diaphorasen (die auch bei dem erstgenannten Vorgang beteiligt sind) auf eine Kette häminartiger eisenhal- tiger Cytochrome (a, b und c) übergeleitet. Vom Cytochrom kann der Wasserstoff noch nicht direkt zu einer Verbindung mit dem molekularen Sauerstoff übergehen, sondern nur unter Vermittlung des sog. „roten Atmungsferments“ von O. Warburg (Cyto- chromoxydase, Indophenoloxydase). 34 Wir besitzen nur eine ganz lückenhafte und ungenügende Vorstellung, wie sich im einzelnen für verschiedene Zellarten, sowie für verschiedene H-Acceptoren und -Donatoren, diese Vorgänge abspielen. Es sind nur recht wenige Teil Vorgänge in den künstlich in vitro zusammengestellten Modellanordnungen nachgeahmt. Wie sich die Sache in Wirklichkeit im Innern der Zellen abspielt, ist jetzt noch nicht zu übersehen. Welche Rolle dabei solchen Redoxsubstanzen, wie Glutathion, Ascorbinsäure, Adrena- lin-Adrenochrom, verschiedene Bakterienpigmente (Pyozyanin, Prodigiosin u. a.), pflanzliche Chinone usw. zukommen kann, ist auch zur Zeit unbekannt. Trotzdem sind die bis jetzt gewonnenen Erkenntnisse auf diesem Gebiete schon sehr wertvoll; sie zeigen uns wenigstens die Richtung an, in der weiter geforscht werden muß und lenken unsere Aufmerksamkeit auf gewisse Körpergruppen, die dabei mitwirken können. Fujita und Kodama (173) untersuchten die Cytochromspektra verschiedener patho- gener Bakterienarten und teilten die untersuchten Keime je nach dem Aussehen der Spektren in sechs Gruppen ein. Die Diphtherie- und Pseudodiphtheriebakterien ge- hören gemeinsam zu der Gruppe IC und besitzen folgende Absorbtionsbänder des Cytochroms: a = 6040 Ä, b = 5620 Ä, c = 5500 Ä, dA = 5320 Ä und d2 = 5220 Ä. Die Atmung der Diphtheriebakterien wurde durch 1 • l(T3n-Lösung des KCN um 20°/o, die der Pseudodiphtheriebakterien um 10 % gehemmt. Auf Blutagar gezüchtet und in einer phosphatgepufferten NaCl-Lösung suspendiert, erwiesen sich diese Keime gegenüber dem KCN relativ unempfindlich. So hemmt die Atmung der Diphtherie- bakterien (bei der Konzentration von 95 °/o in dem umgebenden Gasraum) nur um 2 °/o, der Pseudodiphtheriebakterien um 18 °/o. Durch Belichtung dieser CO-vergifteten Keime tritt nur eine ganz geringfügige Entgiftung und Steigerung der Atmung ein. Daraus ziehen die Autoren den Schluß, daß bei den Diphtherie- und Pseudodiph- theriebakterien die Sauerstoffatmung hauptsächlich nicht über die eisenhaltigen, CN- und CO-empfindlichen Katalysatoren verläuft, sondern sich auf anderen Wegen ab- spielen muß. Weiter ist für die Frage der Rolle der eisenhaltigen Atmungskatalysa- toren bei den Diphtheriebakterien die Arbeit von H. Braun und Guggenheim (165) von Bedeutung. Die Entwicklung der Diphtheriebakterien im Hochschichtagar ohne Fleischwasser und Zucker ist schon bei dem Zusatz von 0,5—1 • KT2 Mol KCN völlig gehemmt. Diese Befunde stehen in einem gewissen Widerspruch zu den Ergebnissen von Fujita und Kodama und deuten auf die Notwendigkeit hin, die Individualität der Stämme, sowie ihre Züchtungsbedingungen bei solchen Versuchen zu berücksichtigen. Bei Anwendung von verschiedenen CN-Konzentrationen werden das aerobe und anaerobe Wachstum der Diphtheriebakterien verschieden stark beeinflußt. 1 • KT2 Mol KCN hemmen das Wachstum der Diphtheriebakterien im Hochschichtagar aerob und anaerob, d. h. auf der Oberfläche und im Innern der Agarsäule. Von 4 • IO-8 Mol ab er- scheint in der Tiefe des Agars — ungefähr 15 mm unter der Oberfläche — ein ring- förmiges Wachstum, das sich bei noch kleineren Konzentrationen nach oben aus- breitet. Bei 1 • KT3 Mol erreicht manchmal das Wachstum schon die Oberfläche des Agars. Anaerob gezüchtete, CN-vergiftete Diphtheriekeime erhalten sich noch 4—5 Tage am Leben, während die aerob gezüchteten und dann mit KCN vergifteten in dieser Zeit zugrunde gehen. Im sauren Milieu ist die KCN-Wirkung stärker als im alkali- schen ausgeprägt. Uber das Vorkommen anderer Atmungskatalysatoren (Dehydrad-Flavinfermente) bei den Diphtheriebakterien wissen wir zur Zeit gar nichts. Weitere Arbeiten auf die- sem Gebiet sind sehr erwünscht, da sie uns dem Verständnis der fundamentalen Lebensvorgänge dieser Keime viel näher bringen werden. 35 3. Kohlehydralvergärung. Die Vergärung verschiedener Kohlehydrate durch Diphtherie- und Pseudodiph- theriebakterien wurde schon seit den ersten Anfängen der Erforschung dieser Keime zu ihrer Differenzierung herangezogen. Hierin liegt die große praktische Bedeutung dieses Zweiges der Biochemie der Diphtheriebakterien. Die fermentative Tätigkeit jeder Zellart ist dem Einfluß von mannigfaltigen Fak- toren des Milieus unterworfen (T°, pH, Substratkonzentration, verschiedene Aktiva- toren und Hemmstoffe, Zusammensetzung des Nährmilieus usw.). Die jeder Bakterien- art sowie -typ innewohnenden enzymatischen Aktivitäten können bei ungeeigneten Milieubedingungen kaum oder gar nicht erscheinen, unter anderen wiederum voll entwickelt sein. Deshalb ist die von Karström vorgeschlagene Einteilung der Fer- mente in konstitutive und adaptive nicht immer eindeutig durchführbar. Eigentlich dürften zur Differenzierung einzelner Bakteriengruppen nur solche fermentative Lei- stungen verwendet werden, die unter allen Umständen bei den betreffenden Keimen vorhanden sind oder fehlen. Und solche absoluten Kriterien gibt es, besonders bei einer so leicht variierenden Keimgruppe, wie die Corynebakterien sicher nicht. Das tritt besonders deutlich hervor, wenn man von groben, rein qualitativen Indikatormethoden zu den feiner arbeitenden, auch kleinere Säuremengen erfassenden titrimetrischen Methoden übergeht. Zahlreiche Forscher haben sich deshalb im Laufe der Zeit bemüht, die Verhältnisse auf diesem Gebiete zu klären und durch die Festlegung möglichst einheitlicher Ver- suchsbedingungen die Grundlage zum Vergleich diesbezüglicher Leistungen einzelner Arten und Typen bei den Corynebakterien zu schaffen. Die dabei gewonnenen Ergebnisse sind zum größten Teile in den Tabellen II und III zusammengestellt. Die bei diesen Arbeiten erkannten Faktoren, die das Endergebnis — die Keim- diagnose — beeinflussen können, sind die folgenden: 1. Natur des zu prüfenden Kohlehydrats. Fast alle bei solchen Vergärungsversuchen gebrauchten Zucker und mehrwertigen Alkohole kommen als chemisch reine, gut defi- nierte Handelsprodukte zur Verwendung, so daß bei ihnen die Bezugsquellen und etwaigen Sortenverschiedenheiten keine Rolle spielen. Nur bei zwei Polysaccharid- Stärkeformen und ihren Abbauprodukten (Dextrinen) bringt die chemische Uneinheit- lichkeit der verschiedenen Handelssorten einen gewissen Unsicherheitsfaktor mit sich. Anderson, Cooper, Happold und MacLeod (187), die als erste den stärkespaltenden Typ Gravis von den beiden anderen — Mitis und Intermedius — abgetrennt hatten, haben auch festgestellt, daß Gravis in gleichem Maße die Mais-, Weizen-, Reis- und Kartoffelstärke vergären kann. Die Art der Sterilisation der stärkehaltigen Lösungen, sowie der eventuelle Phosphatpufferzusatz ändern auch gar nichts daran. Aber schon diese Autoren weisen darauf hin, daß eine zu stark mit Säure behandelte Stärke, die zu viele niedermolekulare Abbauprodukte enthält, auch von Mitis und Intermedius gespalten wird. K. Schürf (239) empfahl zuerst die lösliche Stärke nach Zulkowski, die nach ihm von Intermedius und Mitis nicht in nennenswertem Maße gespalten werden sollte. J. Hohn (209) hat aber beobachtet, daß die Zulkowski-Stärke in nährstoffreichen Sub- straten (Ascites-Bouillon- bzw. Agar) auch von Mitis (etwas träger und weniger von Intermedius) angegriffen wird und zwar ebenso stark wie das Amylum solubile Merck. Außerdem kommen nach diesem Autor auch solche Gravisstämme vor, die (be- sonders bei etwas größerem Trypsinpeptongehalt in der Nährlösung) diese Stärke sehr schwach bis gar nicht zu vergären vermögen. In einer späteren Arbeit teilt Schürf (240) die autoritative Meinung Prof. Stau- dingers mit, wonach die Zulkowski-Stärke als Differenzierungssubstrat abgelehnt wer- 36 den muß. Sie ist zu uneinheitlich zusammengesetzt und enthält niedermolekulare Ab- bauprodukte, die auch von Intermedins sowie Mitis gespalten werden können. Als Ausweg wird die Benutzung von einheitlich zusammengesetztem Glykogen oder einer durch die Methanolfraktionierung von Ballaststoffen gereinigten Stärke empfohlen. Wir haben mit I. Rueßbült (244) eine Anzahl von Handelssorten der löslichen und unlöslichen Stärke (Kartoffelstärke) auf ihre Vergärbarkeit durch die Typen Gravis, Intermedius und Mitis untersucht und dabei gefunden, daß für die praktischen Zwecke einige handelsübliche Typmuster von unlöslicher Stärke brauchbar sind. Bei den meisten löslichen Stärkesorten rief Intermedius eine deutliche Säuerung hervor. 2. Kohlehydratkonzentration. Die Konzentration der zu untersuchenden Lösung an Kohlehydraten beeinflußt in gewissen Grenzen die Höhe der Säureproduktion. So sah Lubenau (221), daß in einer zweiprozentigen Glukoselösung etwas mehr Säure als in der einprozentigen gebildet wird. Dagegen sind die Unterschiede zwischen zwei- und zehnprozentigen Lösungen kaum zu beobachten. Nach Henneberg und Pels-Leusden (206) spaltet Gravis die Stärke unter gleich starker Säurebildung in 0,5 °/o sowie in dreiprozentiger Lösung. Besonders eingehend hat dieses Problem H. Hompesch (213) untersucht. Er fand, daß bei den niedrigeren Glukosekonzentrationen (0,1—1,0%) eine deutliche Abhängig- keit zwischen dieser Größe und der Säurebildung durch Diphtheriekeime besteht. In 24 Stunden bildet z. B. der Typ Intermedius in der einprozentigen Glukoselösung vier- mal soviel Säure als in einer O.lprozentigen. Bei höheren Glukosekonzentrationen (1—10 %) sind aber die Säuerungswerte einander so ähnlich, daß ihre Unterschiede kaum die Fehlerbreite der Methodik überschreiten. 3. Grundnährsubstrat. Noch Th. Smith (1893) und Spronck (1895) wiesen auf die Bedeutung des Grundnährbodens für den Ausfall der Zuckervergärungsversuche bei der Diphtheriediagnostik hin. Die einfachen Fleischwasserbrühen enthalten zu viel von vergärbarem Muskelzucker, so daß die durch seine Spaltung hervorgerufene Säuerung des Nährbodens das eigentliche Bild der Vergärung des zugesetzten Zuckers verwischt. Die Versuche, den Muskelzu'cker durch Vorvergärung mit Colibakterien zu entfernen, müssen als mißlungen betrachtet werden, da bei solcher Prozedur der Nährwert des Substrats selbst erniedrigt ist. Als einen entscheidenden Fortschritt in dieser Richtung muß die Einführung von Peptonsubstraten durch Lubenau (1. c.) und M. v. Riemsijk (235) bezeichnet werden. Man arbeitete eine Zeit lang mit einprozentigen Peptonlösungen, die 0,3—0,5 % NaCl, 5—8 % Lackmus und 1—2 % Zucker enthielten. Schürf (239) verbesserte die Pufferung dieser Lösung durch den Zusatz von Phosphat, später (241) erhöhte er ihren Nährwert durch 10 % Ascites. J. Hohn (210) benutzte in Anlehnung an seine in der TPE-Gruppe gesammelten Erfahrungen eine aus Stierhoden gewonnene Hottinger-Bouillon, die nach ihm auch durch eine Stierhoden-Trypsinpeptönlösung mit Erfolg ersetzt werden kann. Im Not- fall kann man nach seiner Meinung mit einer Phosphatpeptonlösung auskommen. In der Trypsinpeptonlösung, die Glukose enthält, tritt die erste Säuerung schon drei (in Hottinger-Bouillon sogar zwei) Stunden nach der Beimpfung ein. Von einer besonderen Wichtigkeit für die Stärke und Schnelligkeit der betreffen- den Zuckervergärung ist die Art und Menge der in dem Grundsubstrat vorhandenen N-Quellen. Noch Jacobsen (215) hat gezeigt, daß die Säurebildung durch Diphtherie- bakterien in glukosehaltiger Bouillon von ihrer Zusammensetzung abhängt und durch Peptonzusatz erhöht werden kann. Boehnke (192) sah, daß die Ammoniakbildung durch Diphtheriekeime in der Bouillon in Zuckeranwesenheit um 50 % vermindert ist. In unserer oben zitierten Arbeit mit Rueßbült fanden wir, daß die Säurebildung durch Diphtheriekeime aus Glukose am ausgiebigsten in der Hohn’schen Trypsin- peptonlösung erfolgt, während das Schlirf’sche Peptonwasser, Hottinger-Bouillon und Thiel-Larosanlösung in dieser Hinsicht ihr etwas nachstehen. 37 Auch A. Leinbrock (220) sowie H. Hompesch (214) betonen die große Bedeutung der N-Quellen bei der Zuckervergärung durch Diphtheriebakterien. Der letzte Autor fand, daß das Hefeextraktwasser und die Aminosäure-Peptonlösung nach Leinbrock für die Kohlehydratspaltung bei allen Diphtherietypen zu kleine Werte ergeben. Bei den anderen vier geprüften Grundsubstraten treten gewisse spezifische Differenzen im Hinblick auf die Größe der Vergärung von Glukose und Stärke durch einzelne Diphtherietypen auf. Beim Ascitezusatz gleichen sich diese Unterscheide aus. Der Typ Intermedius stellt besonders hohe Ansprüche an das Grundsubstrat. (Vielleicht spielt die p-Aminobenzoesäure eine gewisse Rolle dabei.) Dieser letzte Umstand bildet einen gewissen Fingerzeig für die Erklärung der Zu- sammenhänge zwischen den N-Quellen und der Zuckervergärung durch die Diph- theriebakterien. Es scheint, daß letztere der Stärke des Keimwachstums auf dem be- treffenden Nährboden entspricht. Je üppiger sich die Keime entwickeln, desto gün- stiger sind die Bedingungen zur Entfaltung der bei der Gärung benötigten Fermente. Andererseits werden die N-Körper in Anwesenheit von Zucker und anderen C-Quellen eingespart, so daß in Wirklichkeit der N- und Zuckerstoffwechsel noch enger miteinander verknüpft zu sein scheinen. Von der rein technischen Seite ist es von Wichtigkeit, bei der Titration der in ver- schiedenen N-haltigen Nährböden anfallenden Gärungssäuren den Wert der in zucker- freiem Grundsubstrat durch die geprüften Keime gebildeten Basen (Ammoniak, Amine u. a.) zu berücksichtigen. Diese basischen Körper, die bei dem Zerfall der N-hal- tigen Bestandteile des Grundsubstrats entstehen, können die bei der Zuckerver- gärung sich bildenden Säuren teilweise neutralisieren und dadurch zu niedrige Säure werte Vortäuschen. Aus dieser Zusammenstellung ersieht man, wie kompliziert die Verhältnisse aul diesem Gebiete sind. Von einer weiteren eingehenden Analyse dieser Frage kann man die Aufklärung vieler auch diagnostisch wichtiger Fermentleistungen der Diphtherie- bakterien erwarten. In diesem Zusammenhänge ist von Interesse, kurz auf die Frage des Zystins ein zugehen. Man weiß, daß das Zystin für das Wachstum der Diphtheriebakterien unum- gänglich notwendig ist. Man fragt sich nun, ob diesem Körper eine ebenso wichtige Rolle bei der Zuckervergärung durch Diphtheriebakterien zukommt. W. O. Groß (203) glaubt diese Frage bejahen zu dürfen. Er behauptet sogar, in der Fähigkeit der Para- diphtheriekeime zur Glukosespaltung ohne Anwesenheit des Zystins ein verläßliches Kriterium zur Differenzierung von den echten Diphtheriebakterien gefunden zu haben. Aber noch Henneberg und Pels-Leusden (1. c.) beobachteten, daß die Zugabe von 0,001 °/o Zystin zum Nährboden auf die Säurebildung der Diphtheriebakterien (wenig- stens aus Stärke) keinen Einfluß hat. Später haben J. Burtscher (195) sowie W. Kalies (216) in ihren Versuchen festgestellt, daß die echten Diphtheriebakterien auch ohne Zystinzusatz Glukose unter Säurebildung spalten können. Das Zystin kann diese Tätigkeit der echten Diphtheriebakterien beschleunigen, ist aber für die Glukolyse bei ihnen nicht unbedingt notwendig. 4. Keimeinsaatgröße: Es ist bekannt, daß sich für jede Keimart ein einem ge- gebenen Volumen des Nährbodens mit der Zeit eine Gleichgewichtslage einstellt, bei der die Zahl der durch Vermehrung neuentstehenden Keime die Zahl der absterben- den und sich auflösenden Zellen kompensiert. Dieser Zustand, der nach verschieden langer, von der Menge der eingeimpften Keime abhängiger Zeit erreicht wird, ist durch eine ziemlich konstante Keimkonzentration (Keimzahl pro Volumeneinheit) aus- gezeichnet. Später beginnen die Absterbe- und Autolysevorgänge zu überwiegen, so daß die Keimzahl mehr oder weniger schnell abnimmt. Trotz der Tatsache, daß die Größe der endgültig erreichten Keimkonzentration von der Keimeinsaatgröße nicht abhängig zu sein scheint, ist die Menge der am An- fang des Versuchs eingeimpften Keime für die Stärke und Schnelligkeit von verschie- denen physiologischen Keimaktivitäten nicht belanglos. 38 J. Hohn (212) hat empfohlen, zur Erzielung einer möglichst schnellen Säurebildung aus Kohlehydraten die Diphtheriebakterien in größerer Menge (eine volle Öse) in kleinerem Volumen der Nährlösung (1,5 anstatt 4 ccm) zu verreiben. H. Hompesch (213) sah, daß bei Verwendung von kleineren Keimeinsaaten bei allen Diphtherietypen, besonders aber beim Intermedius, die Säurebildung aus Glukose deutlich verzögert und abgeschwächt ist. Bei Erhöhung der Einsaatmengen verschwin- den die bei kleineren Einsaaten zu beobachtenden Unterschiede in der Stärke der Säurebildung aus Glukose, Fruktose, Mannit und Maltose durch Gravis-, Mitis- und Intermedius-Keime. Dies wird durch die stärkere Vitalität von größeren Inokula er- klärt. Es handelt sich hierbei wahrscheinlich wiederum um die Wirkung von gewissen, in größeren Inokula in bedeutenderen Mengen vorhandenen Vitamine (p-Amino- benzoesäure) und Kofermente (Codehydrasen, Flavine, Häminkörper?). Die Einsaatgröße spielt aber eigentlich nur an ersten Bebrütungstagen eine Rolle. Die Wachstums- und Vergärungsunterschiede verwischen sich im Verlaufe der Bebrütung. Wir (1. c.) konnten mit Rueßbült in unseren Versuchen diese Befunde von Hompesch bestätigen und fanden die Einsaatmenge von ca. 1.19» Keime pro 5 ccm Nährlösung als optimal. 5. Die absolute Menge der aus Kohlehydraten gebildeten Säure scheint von dem Anfangs-pH im Rahmen eines ziemlich breiten pH-Optimums (6,8—8,0) fast unabhängig zu sein. Für die titrimetrisch zu bestimmenden Säurewerte ist aber natürlich keines- wegs gleichgültig, ob der Anfangs-pH = 7,3 oder 7,8 ist. Noch größer ist die Rolle des anfänglichen pH bei den Indikatormethoden, bei denen nicht so sehr die absolute Menge der bei Vergärung anfallenden Säure, als die durch sie bewirkten Verände- rungen im Milieu-pH von Wichtigkeit sind. Je höher der Anfangs-pH des Milieus liegt, desto größer muß die Menge an gebildeter Säure sein, um einen bestimmten, durch den betreffenden Indikator zu erfassenden pH-Umschlagswert zu erreichen. Auf Grund unserer Erfahrung empfiehlt es sich, bei Verwendung von Wasserblau als Indikator den Anfangs-pH-Wert = 7,6 nach der alkalischen Seite nicht zu überschreiten. 6. Keimeigenschaften: Alle bisher besprochenen Momente betreffen zum größten Teil diejenigen Faktoren, die in dem umgebenden Milieu liegen. — Betrachten wir nunmehr den Einfluß der den Keimen selbst innewohnenden Qualitäten auf den Aus- fall der Zuckervergärung. a) v. Riemsdijk (1. c.) hat festgestellt, daß auch bei längerem Aufbewahren von Diphtheriekulturen in der Laboratoriumssammlung ihre Zuckervergärungskraft nicht besonders stark abnimmt, natürlich nur, wenn der Konservierungsnährboden den Keimen zusagt und für das regelmäßige Uberimpfen auf frische Nährböden gesorgt ist (siehe auch D. T. Robinson (236)). b) Wenn alle vorher besprochenen Bedingungen berücksichtigt sind, kann man auf Grund des Ausfalls der Prüfung auf ihre zuckerspaltenden Fähigkeiten die Coryne- bakterien in folgende Gruppen einteilen; Keimart bzw. -typ Stärke Glukose Saccharose Echte Diphtherie-Gravis + + — Intermedius — + — Mitis — + — Paradiphtherie — + + „Echte“ Pseudodiphtherie — — — Es sind im Laufe der Zeit einige Abweichungen von dieser Regel beschrieben. So sind von mehreren Autoren (H. O. Hettche (209), K. Schürf (239), B. Warnecke (247) 39 u. a. echte Diphtheriestämme gesehen worden, die durch ihre äußerst schwache Glukose- spaltung ausgezeichnet sind — die sog. „hypaziden“ Diphtheriestämme, die zum größten Teil dem Typ Intermedius angehören. Weiterhin sind noch von der Forschergruppe von Anderson und Mitarh. (187) mehrere Diphtheriestämme gefunden worden, bei denen die fermentativen Leistungen ihrem Koloniebild nicht entsprachen, und die somit zu keinem der bekannten Diphtherietypen eindeutig zugerechnet werden könnten. Solche Stämme wurden in der Folgezeit von verschiedenen Autoren gesehen und ihrer Typ- angehörigkeit nach verschiedentlich bewertet. Meistenteils wurden sie in der Gruppe der „atypischen Stämme“ zusammengebracht und keinem Typ zugerechnet. So fand z. B. K. Schürf (1. c.) einige Stämme, die die Stärke wie Gravis, Glukose aber kaum gespaltet haben. A. Leinbrock (1. c.) unterscheidet zwei Varianten vom Typ Mitis, von denen eine Stärke vergären kann, die andere aber nicht. H. Großmann (204) hat die Stämme beobachtet (fünf Stämme), die auf der Kartoffelglyzerinplatte nach Clauberg in einer Form, die eine Mittelstellung zwischen Gravis und Mitis einnimmt, wuchsen, aus Stärke aber die Säure nur sehr verzögert bildeten. T. Martelli (223) sah bei einem Mitisstamm (von 78) und bei zwei Intermedius (von 71) die Stärkevergärung, während bei 44 Gravis (von 1S5) diese Aktivität fehlte. 16 Stämme verhielten sich völlig atypisch. K. Bingel (189) beschreibt folgende atypische Stämme; 9 mal — Kolonietaild = Intermedins; Vergärung = Mitis 10 mal — Koloniebild = Gravis ; Vergärung = Mitis 1 mal — Koloniebild = Mitis ; Vergärung := Gravis 1 mal — Koloniebild = Intermedius; Vergärung = Gravis E. Preuner (231) hat die saccharosespaltenden Pseudodiphtheriebakterien gesehen, die keine Glukose spalteten (vgl. die Plusminusvarianten von H. Kliewe (1. c.). Zu allen diesen und noch vielen anderen, hier nicht erwähnten, vom Typ abwei- chenden Diphtherieformen kann man, soweit sie nicht durch die Milieubedingungen, sondern durch die zelleigenen, „endogenen“ Eigenschaften der Keime selbst bedingt sind, folgendes grundsätzlich bemerken: Die Frage der Variabilität bei den einzelligen, sich ungeschlechtlich vermehrenden Mikroorganismen läßt sich sicher nicht nach denselben Prinzipien behandeln, wie bei den mehrzelligen, sich geschlechtlich vermehrenden Metazoen und Metaphyten. Wir kennen bei den Bakterien keine Chromosomen, und wir wissen nicht, ob die bei ihnen beschriebenen Kernäquivalente irgendwelche Rolle bei der Entstehung von Genovariationen (Mutationen) spielen können. Wir wissen sogar nicht, ob solche Muta- tionen überhaupt bei den Bakterien verkommen oder nicht. Bei den höheren Organismen kann man nach dem heutigen Stande der genetischen Wissenschaft behaupten, daß die im Laufe des individuellen Lebens erworbenen Merk- male nur in dem Maße vererbbar sind, in welchem sie bestimmte Veränderungen in dem Genapparat verursachen können (spontane und induzierte Mutationen). Alle übri- gen Variationen sind als nicht vererbbare Modifikationen des betreffenden Indi- viduums zu betrachten. Bei den Bakterien arbeiten wir zudem nicht mit den einzelnen Individuen, sondern mit mehr oder weniger homogenen vegetativ sich fortpflanzenden Keimpopulationen. Die Einzelkulturen könnten dann eventuell als eine Art von „Klonen“ betrachtet werden. Wenn wir bei einer gewissen Bakterienart die Abspaltung von einigen Varianten (etwa der S-R-Übergang, serologische Phasen, fermentative Abarten) feststellen, kön- nen wir mit unseren jetzigen Mitteln nicht entscheiden, ob es sich dabei um die Ver- änderungen der Bakterienerbmasse (echte Mutationen) oder nur um mehr oder weni- ger reversible Dauermodifikationen ihres Phänotyps handelt. Diese Dauermodifika- tionen können sich auf einige Generationen erstrecken und bei Abänderung ihrer Lebensbedingungen zu der Ausgangsform zurückkehren. 40 Für die diagnostische Praxis ist dabei die Frage von entscheidender Bedeutung, in welchem Maße die dabei verwertbaren Merkmale (Morphologie, Biochemie, Serologie) mit den für die Pathogenese bedeutsamen Keimeigenschaften gekoppelt sind. Es ist wichtig, zu wissen, ob die reversiblen oder irresersiblen Veränderungen der Merkmale der ersten Gruppe (diagnostische Merkmale) durch die entsprechenden Veränderungen der Merkmale der zweiten Gruppe (pathogenetische Merkmale) begleitet sind. Diese Frage ist bisher noch für keinen pathogenen Mikroorganismus eindeutig gelöst, weil wir über den Zusammenhang zwischen diesen zwei Merkmalsgruppen recht mangel- haft unterrichtet sind. c) Nach diesen Bemerkungen können wir eine rein kasuistische Skizze einiger neuerer Versuche der Umwandlung von fermentativen Eigenschaften der Diphtherie- bakterien geben. (Die umfassendere Literatur zu dieser Frage ist bei R. Preuß (234) sowie bei K. Ringel (189) zu ersehen. H. Dold (198), F. Weigmann und A. Koehn (248) u. a. haben beobachtet, daß unter dem Einfluß des flüssigen, filtrierten, keimfreien Menschenspeichels die Gravisstämme ihre Fähigkeit, Stärke und Glukose zu vergären (Intermedius und Mitis — nur Glu- kose), irresersibel verlieren und sich in die stabilen, den Pseudodiphtheriebakterien (Typ Hoffmann) sehr ähnlichen Formen verwandeln. N. Erzin (201) sah, daß bei langdauernder Züchtung von Gravisstämmen in einer Bouillon, der 5 °/o des 400-fachen Diphtherie-Heilserums „Behring“ zugesetzt war, nach etwa 14 Passagen (in ca. fünf Monaten) die Abspaltung von schwach tierpatho- genen, weniger lebensfähigen Varianten eintrat. Diese Keime haben ihre Fähigkeit, Stärke zu spalten, stark eingebüßt. Beim Übertragen dieser Varianten auf die immun- serumfreie Bouillon kehrten sie sehr rasch zu ihrer ursprünglichen, stärkevergärenden Form zurück. Auf Grund dieser Beobachtungen kritisierte Erzin die von H. Christison, H. Wright und B. Shearer (197) vorgeschlagene Unterteilung von Typ Gravis in vier Untertypen (je nach ihrer Stärkespaltung und Tiervirulenz) und hält diesen Typ für einen ein- heitlichen. J. F. Murray (226) hat festgestellt, daß einzelne Mitisstämme durch Passagen durch Bouillon, der das Diphtherieheilserum oder normales Kaninchen- oder Meer- schweinchenserum zugegeben wurde, die Fähigkeit der Stärkevergärung neuerwerben können. Der Zusatz des Menschen-, Rinder-, Pferde- und Hammelserums, sowie die Passagen durch Mäuse oder durch aktiv immunisierte Meerschweinchen oder Kanin- chen waren in dieser Hinsicht ohne jede Wirkung. K. Pesch (229) sah, daß die Einimpfung von Diphtherie- sowie von Pseudodiph- theriebakterien in die Hautmuskel wunde beim Meerschweinchen keine Veränderungen in ihren fermentativen Eigenschaften hervorrufen kann. R. Premier (232) konnte durch Passagen von typischen Gravis- und Intermedius- stämmen durch die Schleimhaut v'm Rachen oder Vagina bei Ratten, sowie durch den Körper von Mäusen, Meerschweinchen und Affen ihre Abwandlung in Keime, die den Para- bzw. sehr ähnlich waren, erzielen. Denselben Effekt erhielt er durch Züchtung der Diphtheriekeime in der Braunschen synthetischen Nähr- lösung. Bei diesen Umwandlungen verlieren die Diphtheriebakterien ihre Fähigkeit, Glukose und Maltose zu spalten, erwerben manchmal aber die neue Fähigkeit der Ver- gärung von Saccharose. 7. Chemismus der Zuckervergärung durch Diphtheriebakterien. Unsere Kenntnisse über den eigentlichen chemischen Mechanismus der Zucker- spaltung durch Diphtherie- und Paradiphtheriebakterien über die dabei beteiligten Fermente, ihre Aktivatoren und Hemmstoffe, über die Kinetik dieser Reaktionen, so- wie über die einzelnen Teilvorgänge bei diesen sehr komplizierten enzymatischen Prozessen sind sehr lückenhaft. 41 Fujita und Kodama (172) fanden, daß bei der anaeroben Vergärung durch Diph- theriekeime aus 1 Mol Glukose —2,2 Aequivalent Säuren, hauptsächlich Ameisen- und Milchsäure, weniger Essig- oder Bernsteinsäure entstehen. Die Glukose wird durch den Zystinzusatz gesteigert, durch Monojodessig gehemmt. A. Tasman und A. C. Brandwijk (246) vermuten auf Grund ihrer Versuche, daß sich die Glykolyse bei Diphtheriebakterien auf zwei verschiedenen Wegen abspielt. Einer- seits wird die Glukose unter intermediärer Phosphorylierung in zwei Triosen gespal- ten, die sich über die oxydoreduktiven Reaktionsstufen zur Milch-, Essig-, Propion- und Ameisensäure umbilden. Einen anderen Weg soll die ohne vorhergehende Phos- phorylierung stattflndende Spaltung von 1 Mol. Glukose in je einem C4- und einem C2-Körper darstellen, aus denen später Essigsäure, Äthanol und Bernsteinsäure ent- stehen sollen. Nach L. Birch-Hirschfeld (190) bewirkt das Schütteln der Diphtheriekulturen (Gra- vis in 0—3 °/o Glukosebouillon; pH = 7,4), infolge der besseren 02-Versorgung, einen viel stärkeren Bakterienmasseansatz und eine ausgiebigere Toxinbildung als in den unbeweglich brütenden Kulturen. Die Glukose wird in solchen Schüttelkulturen in 48—72 Stunden vollständig zu C02 verbrannt; aus 100 mg Glukose werden 136,5 mg C02 (theoretisch berechnet soll 133 mg) gebildet. Die Säuerung des Nährbodens ist sehr prompt und stark (pH fällt in 24 Stunden auf 5,4); in zuckerfreier Bouillon kommt es in derselben Zeit zur starken Alkalibil- dung (bis pH = 8,4). Beim Zuckerüberschuß ist die Säurebildung in ccm 0,02-n NaOH: Gesamtsäure Flüchtige Säure Milchsäure Geschüttelt, drei Tage alt 12,2 ccm Nicht geschüttelt, fünf Tage alt 17,1 ccm 7 ccm 11,5 ccm 2 mg °/o 1—3 mg°/o Als flüchtige Säuren wurden Essig- und Ameisensäure gefunden. Bernsteinsäure konnte qualitativ (Pyrrhol-Reaktion) nachgewiesen werden. Bei ihren Untersuchungen über den Chemismus der Stärkespaltung durch den Typ Gravis beobachteten J. Leibowitz, Sh. Avinari-Shapiro (219) daß: 1. die Gravis- und Mitiskeime (lebende Bakterienzellen) Glukose und Maltose vergären können, während das Glykogen ausschließlich von den Graviskeimen gespalten wird; 2. die zellfreien, wässerigen Extrakte oder Autolysate beider Typen das Glykogen zu gärfähigen Zuckern abbauen können; 3. an der Glykogenspaltung durch diese Bakterien die In- taktheit ihrer Zellen nicht wesentlich beteiligt ist. Die Autoren glauben, daß die Ver- gärung von Glykogen ohne seine vorherige enzymatische Hydrolyse wahrscheinlich phosphorolytisch, unter Beteiligung einer nur in den Gravis-Extrakten enthaltenen Phosphatase, erfolgen muß. J. Y. Sugg. W. D. Fleming und J. M. Neill (243) haben in den Gefrierextrakten aus Diphtheriebakterien eine Maltase gefunden. Diese Extrakte greifen Glukose und Sac- charose nicht an. Die Glukosespaltung ist nach diesen Autoren an die morphologisch intakten Diphtheriezellen gebunden, während die Maltase sich von den Bakterien- zellen unter gewissen Umständen abtrennen läßt. In Bouillonkulturflltrate geht sie aber nicht über. Nach F. DiChiara (196) sezernieren die Diphtheriebakterien eine Analyse, die bei 65 0 C und in einem schwach sauren Milieu ihr Optimum hat. Sie spaltet Weizen-, Reis-, Mais- und Kartoffelstärke zu Dextrinen, diese aber zur Maltose. Enzym wird durch NaF, CaCl2, CaSC>4 und gehemmt. 42 4. Urease bei den Corynebakterien 1936 stellte J. Püschel (252) bei den Pseudodiphtheriebakterien (Typ Hof mann) die Fähigkeit zur hydrolytischen Harnstoffspaltung fest, die bei den echten Diphtherie- bakterien fehlte. Diese Eigenschaft wurde als ein neues Differenzierungsmerkmal zwischen diesen zwei Keimarten angesehen und für den praktischen Gebrauch in den diagnostischen Laboratorien ausgebaut. T. Wohlfeil und P. Weiland (253) fanden, daß von den darauf geprüften 20 Pseudodiphtheriestämmen alle, von 81 echten Diphtherie- bakterien sämtlicher drei Typen keinen Harnstoff spalteten. Als die notwendige Vor- bedingung für eine erfolgreiche Untersuchung dieser Keime auf Urease bezeichnen sie die absolute Reinheit der Stämme. Im Vergleich mit sechs anderen Keimarten ist die Ureaseaktivität von Pseudodiphtheriebakterien als mittelstark zu bezeichnen. Kleinsorgen und Commicbau (250) haben eine Indikatorplatte mit Harnstoff zwecks praktischer Differenzierung der Diphtherie- und Pseudodiphtheriebakterien ange- geben. Alle diese Befunde sind in der letzten Zeit durch Warnecke, 1. c. Preuner, 1. c. Merkel (251) u. a. nachgeprüft worden. Es wurden dabei gewisse diphtheroide Stämme gesehen, die die Schärfe der Grenze zwischen den Diphtherie- und Pseudodiphtherie- keimen im Hinblick auf diese Eigenschaft — Harnstoffspaltung — etwas verwischen. Man wird ihr deshalb bei der praktischen Auswertung mit Vorsicht begegnen müssen. 43 IV. Diphtherietoxin Das lösliche Diphtherietoxin ist der bestuntersuchte Wirkstoff der Diphtherie- bakterien. Seine chemischen und immunobiologischen Eigenschaften wurden in der letzten Zeit mehrmals in der Literatur von namhaften Forschern auf diesem Gebiete eingehend geschildert (H Schmidt (258), Th. Wagner-Jauregg (260), M. D. Eaton (255), A. Wadsworth (261), P. Bordet (254), O. Ramon (257), Loiseau et Philippe (256), A. Strom (259) — u. a.). In diesem Bericht betrachten wir das Problem des Diphtherie- toxins und der diphtherischen Intoxikation beim Menschen und beim Tier vom rein pathophysiologischen, oder besser vom toxikologischen Standpunkt aus. Wir wollen versuchen, uns aus den bisher bekanntgewordenen physikalischen und chemischen Eigenschaften des Diphtherietoxins — dieses stark wirksamen spezifischen Proteins der Diphtheriebakterien — sowie aus der Natur der bei einer experimentellen Diph- tberieintoxikation bzw. im Verlaufe einer klinischen Diphtherieerkrankung festzu- stellenden Störungen einzelner Funktionen des erkrankten Organismus, ein Bild über das Wesen der diphtherischen Intoxikation zu machen. Dabei wird auf die immuno- biologischen Fragestellungen nicht eingegangen und die an ihnen interessierten Leser an die Arbeit von H. Schmidt (258) angewiesen. 1. Toxinbildung in vitro a) Nährböden. Vom Standpunkt der chemischen und biologischen Erforschung des Diphtherie- toxins bieten die proteinfreien synthetischen und halbsynthetischen Nährböden viele Vorteile. Darum bemühten sich mehrere Autoren, die Diphtheriebakterien auf solchen Substraten mit möglichst höheren Toxinausbeuten zur Entwicklung zu bringen. Bei Züchtung auf älteren synthetischen Nährböden — etwa auf dem Substrat von Uschinsky (A. Wadsworth und M. Wheeler (319) trat schon nach einer Passage eine Abnahme der Virulenz und Toxinbildung der eingeimpften Diphtheriebakterien ein. Erst in Anlehnung an die von H. Braun und Hofmeier entwickelte Herstellungsvor- schrift gelang es E. M. Maver (287), ein Toxin in synthetischer Lösung mit Dlm = 0,1 ccm herzustellen. Dazu wurde der Zystingehalt der Lösung vervierfacht, das Glykokoll zugesetzt und das Na-asparaginat durch Asparagin oder Ammonium- succinat ersetzt. Die Stämme mußten vorher eine Zeitlang an das Wachstum in syn- thetischer Lösung adaptiert werden und ein gutentwickeltes Häutchen darauf bilden können. H. Lindemann (278) züchtete neun Diphtheriestämme (davon sechs von „toxi- schen“ und drei von „gewöhnlichen“ Diphtheriefällen) auf dem Original-Braun-Nähr- boden, erhielt er aber nur bei zwei Stämmen eine geringe Toxinausbeute. Der Zusatz von 1 °/o hydrolisierten Peptons verbesserte die Toxinbildung nicht. In Anwesenheit von 1 % nicht hydrolisiertem Pepton erfolgte eine gute Toxinbildung. Erst A. M. Pappenheimer und S. J. Johnson (292, 294) gelang es, auf einem halb- synthetischen Substrat, das aus einem Säurehydrolysat der Gelatine mit Zusätzen von Methionin, Zystin, Tryptophan, Maltose, Dextrose, Na-laktat, Salzen und einem Wachstumsfaktor aus Hefe bestand, ein Toxin mit 30—40 Lf pro 1 ccm nach sechs- tägiger Bebrütung zu gewinnen. Später erhielten A. M. Papenheimer, J. H. Mueller und S. Cohen (295) auch in einer rein synthetischen Lösung hochwertiges Toxin (Dlm = 0,0007 ccm; 36 Lf pro 1 ccm). Die Lösung wurde aus acht Aminosäuren, Pime- linsäure, Nikotinsäure, /?-Alanin. Salzen, Maltose, Dextrose, Na-laktat zusammen- gesetzt und besaß einen N-Gehalt von 70 mg °/o. Der verwendete Stamm war Park- Williams Nr. 8. 44 In der neueren Zeit wurden von verschiedenen Forschergruppen viele Versuche vorgenommen, um die älteren Nährböden für die Toxingewinnung besser auszugestal- ten. Es wurden dabei die neueren Erkenntnisse auf dem Gebiet der Ernährungs- physiologie der Diphtheriebakterien mitverwertet. Im Institut Pasteur ging man dabei von der jahrelang erprobten Martin-Bouillon aus, die im Prinzip aus einem Gemisch von Kalbfleischbouilion und pepsinverdautem Schweinepansenextrakt besteht. 1929 schlug G. Eamon (306) einen Nährboden vor, der aus dem Mazerationssaft von Kalb- fleisch mit Zusatz von 0,15 °/o Glukose und Pepton bestand (pH = 8,0—8,5). Mit einem frischgezüchteten Stamm erhielt er nach vier Vorpassagen und Löfflerserum ein Toxin mit Dlm = 0,01 ccm. Nach Zusatz von Schweinemagenpepton zu dieser Bouillon steigerten im nächsten Jahr D. d’Antona (264) und O. Nureddin (291) die Toxinaus- beute und erhielten Toxine mit Dlm = 0,002—0,001 ccm und 16—20 Lf pro 1 ccm. Weiterhin setzten G. Ramon und A. Berthelot (309) dieser Bouillon noch 0,5—1,0 Vo Na-azetat hinzu und erhielten in solcher Nährlösung (pH = 7,7—8,0) ein Toxin mit 24—30 Lf pro 1 ccm. Um möglichst bessere Toxinbildung zu erzielen, muß der Gehalt an Kalbfleischmazerat mindestens Vio des Gesamtvolumens des Substrats betragen, (G. Loiseau und M. Philippe (281, 282)). In einer pepsinverdauten Kalbfleischbouillon mit Glukose und Na-azetat erhielt G. Ramon (307) ein Toxin mit 30—40 Lf pro 1 ccm. E, M. Taylor (317, 318) verwendete die pepsinverdaute Schweinemagenbouillon mit Maltose bei einem Verhältnis von Nährbodenoberfläche: Nährbodenmasse = 1 qcm : 2 ccm und gewann ein Toxin mit ca. 100 Lf pro 1 ccm. Endlich berichteten G. Ramon und Mitarb. (308), daß es ihnen gelungen ist mit Hilfe von einer papainverdauten Pferdefleischbouillon mit 0,5 % frischer Bäckerhefe, Glukose, Maltose und Na-azetat eine Toxinlösung herzustellen, die Dlm =0,0003 bis 0,00025 ccm. besaß (12 Tage Bebrütung bei 35 °). Auch in China (C. C. Young (322, 323)) wurden Versuche zur Verbesserung der Martin-Bouillon unternommen. Die Kalbfleischbrühe wurde durch pepsinverdautes Pferdefleisch ersetzt und gewisse technische Neuerungen bei der Zubereitung einge- führt. Damit wurden Toxine mit Dlm weniger als 0,001 cc. und 21,6 Lf pro 1 ccm. gewonnen. Einen etwas anderen Weg schlugen die englischen Forscher in Beckenham ein. Aus- gehend von den Arbeiten von A. Watson und E. Longstaff (321) verwendeten sie trypsinverdautes Pferdefleisch. Nach Zugabe von Proteosepepton und Na-azetat er- hielt C. G, Pope (300) zuerst einen Nährboden, auf dem Toxine mit Dlm. bis 0,00038 ccm erzielt wurden. Nach weiterer Verbesserung durch Bäckerhefe- und Mal- tosezusatz, bei Einhaltung von t °-Optimum = 32—35,5 0 und optimalem Oberflächen- verhältnis gewann er zusammen mit M. L. Smith (303) ein Toxin mit Dlm = 0,00025 ccm. Französische Forscher erhielten mit dieser Bouillon bei einem Gesamt-N-Gehalt von 140—160 mg Vo ein Toxin mit Dlm = 0,0005 ccm und 30—68 Lf pro 1 ccm (A. Berta und C. Garcia (265)). Dieser Nährboden hat unter dem Namen von Bouillon nach Pope und Smith in der Folgezeit Eingang in die meisten Toxin herstellenden Loboratorien gefunden. D. Snajder und Lj. Jovanovic (316) erhielten mit Popescher Bouillon bei 40 °/o ihrer Herstellungsserien Toxine mit 16—48 Lf pro 1 ccm. O. Hida und S. Suzuki (272) fan- den als für Toxingewinnung optimales Medium auch eine Pferde- bzw. Rindfleisch- bouillon mit Pepton und Dextrose bei sechstägiger Bebrütung. Einen dem Medium nach Pope-Smith ähnlichen Nährboden haben K. Ando und T. Komiyama (262) ver- öffentlicht, der aber, da er als N-Quelle nur Proteosepepton enthielt, ein Toxin mit Dlm = 0,002—0,0006 ccm. und nur 11—18 Lf pro 1 cmm. lieferte. Weitere fieischbrühefreie, peptonhaltige Nährböden für Toxingewinnung wurden auch von A. Wadsworth (320), M. Marbe und A. Olariu (283), sowie von S. Hosoya und 45 Mitarb. (273) vorgeschlagen. Sie stehen den fleischbrühhaltigen Substraten im Hinblick auf die Toxinausbeute nach. Aus dieser kurzen Zusammenstellung ersieht man, daß die meisten Erfolge bisher einerseits mit der Popeschen trypsinverdauten Pferdefleischbrühe, andererseits mit der zuletzt veröffentlichten papainverdauten Pferdefleischbouillon nach Eamon er- zielt wurden. b) Die Toxinbildung beeinflussende Faktoren. Diese Erfolge bei der Toxingewinnung wurden hauptsächlich durch eingehendes Studium verschiedener dafür in vitro maßgebender Faktoren gewonnen. 1. Die Bemühungen eine für die Toxinbildung geeignete N-Quelle zu finden, haben zur Anwendung verschiedener obenzitierten Fleischverdauungsprodukte geführt. Die Rolle des dabei zugesetzten Peptons wurde von O. Hida und S. Suzuki (1. 1. cit.) ge- prüft, welche das albuminreiche und aminosäurefreie Pepton als für die Toxingewin- nung besonders geeignet gefunden haben. Von Aminosäuren förderten Arginin und Histidin die Toxinbildung. W. E. Bunney und L. E. Thompson (267) untersuchten ver- gleichsweise verschiedene amerikanische Peptonsorten und fanden die Difco-Protone und Proteosepepton Nr. 2 als besonders für die Toxingewinnung geeignet. 2. Die Bedeutung des Kohlehydratzusatzes für die Toxinentstehung in einem halb- synthetischen Medium hat C. G. Pope (301) geprüft. Das Grundsubstrat enthielt Pep- ton, Na-azetat und Salze. Durch Zusatz von Glukose, Fruktose, Galaktose und Na- succinat wurde die Toxinausbeute gefördert, sie blieb aber immer hinter fleisch- wasserhaltigen Substraten zurück. Maltose in einer Konzentration von 0,04 °/o in Bouillon wirkte optimal und erlaubte Gewinnung eines Toxins mit 93 Lf pro 1 ccm (C. G. Pope und Mealey (304)). E. J, Hazen und G. Haller (269) fanden, daß Glukose in kleinen Mengen (0,15 °/o) günstiger auf die Toxinbildung wirkt als Maltose oder Glyzerin. Dextrin war wir- kungslos. Optimum wurde bei 0,15 % Glukose und 0,3 °/o Maltose erreicht, wenn die Zucker der Bouillon vor der Beimpfung zugesetzt waren. Weitere Zusätze von 0,15 % Glukose bzw. 0,075 % Maltose zweimal täglich während der Keimentwicklung be- schleunigten die Toxinproduktion sehr. M. Marbe u. a. (284, 285) fanden, daß Zusatz von 0,2 °/o Glukose, 0,6 % Maltose und 1 °/o Na-azetat zur Bouillon in sieben Tagen zu einer dreifachen Ausbeute an Toxin gegenüber der zuckerfreien Bouillon führte. Es wurde dabei ein Toxin mit 45—55 Lf pro 1 ccm erhalten. O. Hida und S. Suzuki (1. c.) beobachteten, daß 0,2 °/o Glukose das Optimum darstellt; schon 0,3% hemmen die Toxinentstehung. 3. Daß gewisse Kationen und Anionen, besonders Phosphate, für das Wachstum der Diphtheriebakterien notwendig sind, haben besonders deutlich die Arbeiten von Braun und Mitarbeiter gezeigt. A. Wadsworth und M. Wheeler (319) erzielten in einer Pepton- lösung gute Toxinausbeute, die außer Glukose noch die Ionen: Natrium, Calcium, Magnesium, Chloride, Sulfate und Phosphate enthielt. Calcium war durch Barium und Strontium, nicht aber durch Mangano- und Magnesium-Ionen ersetzbar. Zur kräftigen Toxinproduktion sollten Calcium und Phosphationen zusammen mit Pepton erhitzt werden. Die Zugabe von kolloidalem Kalziumphosphat steigerte die Toxinausbeute auf das 10—lOOfache. 4. Was die Schwermetalle anbetrifft, fanden A. Leulieu, P. Sedaillan und J. Clavel (276, 277), daß bei Verwendung eines kupferhaltigen Filtermaterials (vom Nickelbelag entblößten Kupfertrichter), sowie in Anwesenheit von absichtlich zur Bouillon zugesetzten Kupfersulfats und anderer Cu-Verbindungen, die Diphtherie- bakterien imstande sind, das Kupfer zu speichern. Bei Ausflockung des Toxins geht das Kupfer in den Niederschlag über. Das gespeicherte Kupfer läßt sich aus lebenden Bakterien durch Waschen nicht entfernen. A. Locke und E. R. Maine (279) sahen, daß 46 es bei Erniedrigung des Cu-Gehalts im Nährboden (durch Zystin- bzw. sowie durch die Erhöhung des Fe- und Mn-Gehalts (Fe als Natriumferrozyanid oder Ferrizitrat) zu einer Abschwächung der Toxinbildung kommt. Als optimal wurde das Verhältnis Cu : Fe = 10—20 : 1 gefunden. Beim Verhältnis 1 : 1 erhielt man nur Vsu des optimalen Toxinwerts. Pope (302) aber fand im Gegenteil, daß ein gewisser Eisengehalt (bis 508 °/o in einem halbsynthetischen Medium auf die Toxinbildung fördernd wirkt; Cu wirkt etwas schwächer. Die durch Glukosevergärung in diesem Medium bewirkte Säuerung schlägt in Anwesenheit von Schwermetallen schneller ins Alkalische um. In Trypsinbouillon dagegen hemmt das Eisen die Toxinbildung; Cu verhält sich indifferent. G. und J. Scheff (310) beobachteten, daß in der Popeschen Bouillon ein gleichzeitiger Zusatz von Cu (200—350 */o) und Zystin (40—60 mg °/o) die Toxinausbeute verstärkt, während Fe und Zystein ungünstig wirkten. Bei Anwendung von Difco-Bactopepton, das zystinarm ist, mußte man zur Erzielung guter Toxinausbeute Zystin hinzustzen. A. M. Pappenheimer und S. Johnson (293) behaupten, daß die Spuren von Schwer- metallen aus den bei der Toxinherstellung verwendeten Glasgefäßen die Höhe der Toxinerzeugung bis zu mehr als ±100 % beeinflussen können. Für das Eisen fanden sie die Konzentration von 14y°/o als optimal, für Cu-80y°/o; schon bei 50y°/o Fe bzw. 6 mg w/o Cu trat die Hemmung ein. In der neuesten Zeit berichten H. O. Hettche und M. Becker (271), daß Fe, auch als komplexes Ferrikation, in Konzentrationen von 5—50y°/o in Pope-Bouillon den Toxin- verlust bis zur Toxinfreiheit bewirken kann; das Bakterien Wachstum, dagegen unbe- einflußt läßt. Eisen, als Komplexanion, sowie Ni und Co bleiben ohne Wirkung. Cu setzt die Toxinbildung nicht herab, wirkt aber als Desinfiziens auf Bakterien. Eine fördernde Wirkung wurde nicht beobachtet. Man sieht, daß trotz zahlreicher dieser Frage gewidmeter Untersuchungen, die An- schauungen über die Bedeutung von Schwermetallen für die Diphtherietoxinbildung noch jetzt widerspruchsvoll sind. 5. Von sonstigen Biokatalysatoren fand A. Mustafa (234, 235) die vitaminreichen Hefeextrakte, sowie einen Auszug aus Erythrozythen als die Toxinbildung fördernd. Das reine Aneurin steigert, besonders in Anwesenheit von einer französischen Han- delssorte des Peptons, die Toxinausbeute um 5—6 Lf pro 1 ccm. Das Laktoflavin ver- bessert die Toxinausbeute um ca. 20 Lf pro 1 ccm. P. Bordet (266) gewann in zucker- haltiger Bouillon nach Zugabe von Bäckerhefe das Toxin mit einem Titer von 45 Lf pro 1 ccm. In zuckerfreien Media blieb der Effekt aus.1) J. J. Kligler (274) hat gefunden, daß der Zusatz von Ascorbinsäure (0,05—0,1 °/o) die Toxinbildung in vitro hemmt. Der Toxinverlust geht bis auf V20 der ascorbinsäure- freien Kontrolle. Da auch der nachträgliche Zusatz von Ascorbinsäure das Toxin ent- giftet, wird dabei eine Redoxwirkung des Vitamins vermutet. Nach M. Wheeler und M. Crowe beeinflußt der Phorphirinzusatz zum Nährboden die Toxinbildung nicht. M. und T. Philippe (296) sahen, daß nach dem Zusatz von Schweinepansen Muzin zur Bouillon eine Hemmung des Wachstums der Diphtheriebakterien bei den Muzingen- mengen größer als 0,2 gr pro Röhrchen auftrat. Auch die Toxinbildung nahm mit zu- nehmender Muzinkonzentration ab. Auf das fertige Toxin dagegen wirkt das Muzin stabilisierend. *) P. Bordet hat festgestellt, daß die Nikotinsäure bei Toxinbildung und Zuckerver- wertung bei den Diphtheriebakterien begünstigt; das Nikotinamid wirkt schwächer. J. Annok und J. Buchgraber (263) sahen, daß von den damals bekannten Vitaminen — A am wenigsten, B — (aus dem Hefesaft) — am stärksten, Lebertran — deutlich die Bildung des Diphtherietoxins in vitro verstärken. Die Toxinbildung von Diph- theriebakterien wird nach Komis (275) durch die Anwesenheit von schwach gärender Hefe gefördert. 47 6. Für die Toxinbildung sind weiter noch die ph-Verhältnisse im Nährsubstrat wäh- rend der Bebrütung von Bedeutung. Diese Frage ist mit der Zusammensetzung der Gasphase in den Kulturgefäßen, sowie mit verschiedenen Dissimilationsprozessen der Diphtheriebakterien engst verknüpft. W. N. Plastridge und L. F. Rettgen (299) haben gezeigt, daß die Haltbarkeit des gebildeten Toxins zum großen Teil auf dem pH und COo-Gehalt der Kulturflüssigkeit beruht. Optimal ist pH = 7,0 und eine nicht zu große Menge von CO2. Bei einem pH—6,0 kommt es zu einer Toxizitätsabnahme auch bei in zugeschmolzenen Röhrchen aufbewahrtem Toxin. Bei pH = 7,0—8,0, beim Durchströmen der Toxinlösung mit kohlensäurefreiem 50 % Sauerstoff kommt es zu einem Toxizi- tätsverlust, der bei Zusatz von 5 °/o C02 zum Sauerstoff ausbleibt. Diese Toxinzerstö- rung geht desto schneller vor sich, je größer der pH-Wert ist. Bei pH = 9,0 wirkt die C02-Zugabe konservierend, weil sie den pH-Wert auf 8,0 erniedrigt. Auch Hazen und Heller (1. c.) berichten, daß die stärksten Toxine mit Nährböden erzeugt werden, die ein Anfangs-pH = 7,1 haben. Die pH-Änderungen während der Toxinbildung seien kein sicheres Kriterium für die Toxinreife und die Toxinausbeute stehe in keinem Zusammenhang mit dem End-pH. Diese Befunde wurden auch von S. Schmidt (311) bestätigt, der auch keine Abhängigkeit zwischen dem Anfangs-pH des Mediums und der Toxinbildung fand. Er erhielt die Toxine mit höheren antigenen Qualitäten bei pH = 7,3—8,9. Dagegen beeinflußt der pH-Wert das Verhältnis (Toxizi- tät; antigene Wirksamkeit) des Toxins in höherem Grade. Später (S. Schmidt und Fjord-Nielsen (312)) verglich er die pH-Änderungen mit dem Toxingehalt während längerer Züchtungsintervalle und fand, daß: 1. die pH- Werte folgenden Verlauf hatten — Anfangs-pH = 8,3; in ersten Tagen sinkt er auf 6,5; am 32. Tag —8,9; 256. Tag —8,7; 512. Tag —8,0. 2. Das Toxin hat bis zum vierten Tage zugenommen, dann blieb es bis zum 32. Tag fast unverändert; später trat eine schnelle Abnahme ein, und am 256. Tag waren nur noch sehr geringe Mengen, am 512. Tag nur Spuren von Toxin vorhanden. M. Wheeler und M. Crowe (90) verfolgten die parallele Toxin- und Porphyrinbil- dung durch Diphtheriebakterien in fleisch wasserfreier Peptonlösung und haben festge- stellt, daß die beiden Substanzen gleichzeitig unter denselben Bedingungen auftreten. Wir wissen aber, daß diese Parallelität nur mit einer Identität der Bildungsbedingun- gen, nicht aber der Substanzen selber, erklärt werden kann. Interessant war auch da- bei, daß bei Erniedrigung des G2-Gehalts in der Gasphase eine deutliche Hemmung in der Bildung beider Substanzen eintrat, die durch den Zusatz von 1 °/o C02 gar nicht, von 5 °/o bis zur Hälfte, von 10 °/o vollkommen wieder beseitigt wurde. Auch C. Siebenmann (313) wies auf die große Rolle der ausreichenden Sauerstoff- versorgung und ausreichender Oberflächenentwicklung der toxinbildenden Kulturen hin. M. Marbe und Mitarbeiter (286) behaupten, daß das Diphtherietoxin in drei 1t. Kolben bei 37 0 in fünf, in solchen von 100 ccm schon in 1—1,5 Tagen „reif“ wird. C .C. Pope und M. Mealey (305) beobachteten, daß die Toxinbildung nur dann gut vor sich geht, wenn nichts eine normale Entwicklung des Bakterienhäutchens auf der Bouillonoberfläche stört. Das hängt damit zusammen, daß Wachstum und Toxinbildung nur an der Oberfläche stattflnden. Besonders wird die Toxinbildung begünstigt, wenn die ausgebildeten Häutchen nach einer gewissen Zeit von sich aus zu Boden sinken und sich an ihrer Stelle neue bilden. Manchmal erschöpft aber schon das erste Häut- chen die Produktionsmöglichkeit des Milieus, und eine weitere Häutchenbildung bringt keine Toxinzunahme mit sich. R. H. Heeren (270) fand, daß von 115 Subkulturen von 12 frisch isolierten Diphtheriestämmen im flüssigen Nährboden; 89 — Toxin und Häutchen, 11 — Toxin ohne Häutchen, : 6 — kein Toxin, aber Häutchen und 9 — kein Toxin und kein Häutchen bildeten. 48 Säurebildung bei der Zuckervergärung durch verschiedene Corynebakterien. Tabelle III. Verfasser Grundsubstrat % des Zuckers Normalität der Lauge; Gebildete Säuremenge in n. 10 3 Aequivalent einer einbasischen Säure. Keimart bzw. Keimtyp Anfangs-pH; Bebrütungs- Indikator Glukose Maltose Saccharose Stärke Glykogen Dextrin Galaktose Fruktose Bitter, Gundel und Sancho (1926) 191 Peptonwasser 11%; 0,1-n; 2 Tage Phenolphthalein 0,20—1,40 0,05—1,10 0,00—0,30 Diphtherie Diphtheroide Pseudodiphtherie Kliewe (1927) 217 Bouillon; 1% 0,1-n; 5 Tage Phenolphthalein 0,20—1,60 0,00—1,20 1,40 0,40 Tierpathogene Diphth.-Ia Tierpathogene Diphth.-Ib Hettche (1936) 207 Bouillon; 2% 0,1-n; pH-7,38 5 Tage; Phenolphthalein 1,80—2,10 0,40—0,70 * Normazide Diphtherie Hypazide Diphtherie Hettche (1936) 208 Hottinger-Bouillon; 1% 0,1-n; Universalindikator Merck 1 0,00—0,20 0,60—1,00 0,60—1,00 1,80 2,60 —0,20 Gravis-Normazide Diphtherie Intermedius-Hypazide Diphth Mitis-Mesazide Diphth Hyperazide-apathog. Diphth Hyperazide Pseudodiphtherie Pseudodiphtherie Schürf (1938) 239 Phosphatpepton wasser; 1%; 0,025-n; 7,3—7,4; 3 Tage Phenolphthalein 1.00 —1,45 1.00 —1,33 0,50 —0,75 0,025—0,10 —0,10 —0,05 1,05 —1,15 ± 0,05 ± 0,03 -0,13- + 0,03 ± 0,03 —0,03—0,05 0,93—1,47 0,97—1,40 0,67—0,75 0,50—0,65 0,93—1,07 0 —0,13—0,05 Gravis Mitis Intermedius Hypazide Diphtherie Pseudodiphtherie Hyperazide Pseudodiphtherie Bohr (1939) 193 Peptonwasser nach Schürf; 0,025-n 1,00 1,10—1,47 0,02 -0,17- + 0,12 1.13 -0,37- + 0,03 Gravis — 1 Stamm Mitis — 13 Stämme Schürf (1940) 241 Pepton wasser nach Schürf; wie vorher, nur pH—7,6—7,8 rd. 1,50 rd. 1,50 rd. 0,75 1,25—1,30 0,05—0,45 -0,10- + 0,35 rd. 1,50 0 0 0,75—1,75 0,55—0,65 0,35—0,45 0,55—0,65 1,30—1,45 0,45—0,60 rd. 1,50 rd. 1,50 rd. 0,75 Gravis Mitis Intermedius Warnecke (1940) 247 Pepton wasser nach Schürf; 0,025-n; 2 Tage: Phenolphthalein 0,87—1,25 0,50 0,75—2,75 0,87—2,50 0 0 0,62—1,87 0,37 0,50—1,25 / Gravis Intermedius Mitis Hohn (1941) 21 Hottinger-Bouillon aus Stier- hoden; 1 %; 0,025-n; pH—7,9—8,0; 1 Tag; Phenolphthalein 2,15 0,90 2,00 . 0 0,10 0 1,50 0,20 0,05 Gravis Intermedius Mitis Wie vorher mit Pepton v/asser 1,10 0,65 1,35 0 0,05 0 0,75 0,05 0,05 1,11 0,02 0 0,64—0,84 0,18—0,26 0,06—0,17 0,23—0,49 0,31—0,54 0,24—0,43 0,96—1,05 0,92—1,08 0,45—0,61 Gravis Intermedius Mitis Leinbrock (1942) 220 Peptonwasser; 1%; 0,04-n; 7,6; 3 Tage; Mischindikator 1,90—2,00 1,00—1,30 1,70—2,00 0 0 0 1,40—1,90 0 0,90—2,00 Gravis Intermedius Mitis (Stärke + und Stärke —) Hompesch (1942) 213 Pepton wasser; 1%; 0,04-n; 7,6; 3 Tage; Phenolphthalein 0,87—1,06 0,65—1,07 0,32—0,56 0,62—0,84 0,48—0,83 0,31—0,64 0 0 0 Inulin, Raffinose, Rhamnose, Xylose, Arabinose, Sorbose, Adonit, Dulzit, Mannit und Sorbit wur- den von keinem der geprüften Keime vergoren. Gravis Mitis Intermedius Mannit Laktose Glyzerin Glyzerin—5% 0,82—1,09 0,53—1,00 0,38—0,67 0,06—0,15 0,07—0,15 0,04—0,13 0,21—0,23 0,17—0,18 0,18—0,20 Gravis Mitis Intermedius Maltose Glyzerin Gravis Intermedius Mitis Paradiphtherie-Hyperazide Pseudodiphtherie Groß (1943) 203 Bouillon; 0,01-n; 3 Tage; Phenolphthalein 0,45—0,47 0,10—0,15 0,71—0,81 1,16—1,75 0,43 —0,02 0,12 —0,09 Tarnovski und Rueßbült Serumpepton wasser; 1%; 0,02-n; 7,6; 3 Tage Phenolphthalein 2,14—3,94 -0,0-+ 0,24 3,13—3,59 Diphtherie Gr Pseudodiphtherie Paradiphtherie (1943) 244, 245 Hohn-Pepton wasser; 1%; 0,04-n; 7,6; 3 Tage; Phenolphthalein 1,96—4,84 1,45—3,21 2,80—3,42 1,88—4,05 1,13—1,95 0,02—0,10 0,06—0,19 —0,21—0,09 Gravis Intermedius Mitis Paradiphtherie Erläuterungen zur Tabelle III: 1) Die in den einzelnen Arbeiten von obenzitierten Autoren angegebenen Daten, die alle in ccm der verbrauchten Lauge angeführt sind, wurden zwecks besserer Über- sichtlichkeit in die pro 100 ccm der entsprechenden Nährlösung gebildeten Milli- grammäquivalente einer einbasischen Säure umgerechnet (1 ccm verbrauchter 0,1-n- Lauge entspricht der Bildung von 1.10-4 Äquivalent einer einbasischen Säure). Hierbei mußte man die verschiedene Größe der titrierten Versuchsproben (gewöhnlich 5 bis 10 ccm), sowie die verschiedene Normalität der angewandten Laugelösungen und in einigen Fällen (z. B. bei Lainbrock) auch die verschiedenen Umschlagswerte des pH der angewandten Indikatoren durch Rechnung berücksichtigen. 2) Wo von den Verfassern auch die Werte für die Säure- bzw. Alkalibildung in dem entsprechenden zuckerfreien Nährboden angegeben waren, konnten wir mit ihrer Hilfe die „korrigierten“, der wahren Säurebildung aus dem zugesetzten Zucker ent- sprechenden Werte ermitteln. Für die Konservierung der Vitalität und Toxinbildungsfähigkeit der Diphtherie- bakterien sind aber die haibanaeroben Züchtungsbedingungen viel günstiger. *Zu die- sem Zweck benutzte M. Philippe (297, 298) die Überschichtung der Bouillonkulturen mit Parafflnöl, A. und E. Zink (324) sahen aber, daß auch unter diesen Bedingungen ein langsamer, aber irreversibler, von einer kokkoiden Entartung der Diphtheriebakterien begleiteter Toxizitätsverlust erfolgt. 7. Der Einfluß, den die Anzahl der Passagen der Diphtheriestämme in synthetischer Lösung auf die Toxinbildung hat, überprüfte Maver (288) und beobachtete, daß von 31 frisch isolierten Diphtheriestämmen nach erster Passage — bei zehn, nach zwei Pas- sagen — bei 15 eine kokkoide Entartung eintrat. Die erhaltenen Varianten unterschie- den sich von den Ausgangskulturen in fermentativer und antigener Hinsicht stark. E. Simon (315) berichtet über einen bald positiven, bald negativen Einfluß der Passagen auf die Toxinbildung von neun Diphtheriestämmen. Als Nährboden wurden die mit elf verschiedenen Sera hergestellten Löffler-Platten benutzt. Dabei spielte die Indi- vidualität der Stämme eine sehr große Rolle. Der Zusatz von Menschenserum zum Diphtherienährboden übt bei Sera von manchen Individuen einen Einfluß auf die Toxinbildung der Diphtheriebakterien aus. Diese Eigenschaft der Sera hängt mit keiner bestimmten Krankheit der Serumspender zusammen (M. Frank (268)). 8. A. Locke und E. R. Maine (280) konnten in der Toxinbildung des Stammes Park-Williams Nr. 8 keine jahreszeitlich bedingten Saisonschwankungen feststellen. Der Nährboden selbst erleidet im Laufe der Toxinbildung eine Reihe von ganz charakteristischen Veränderungen: der Proteingehalt steigt an, die Lichtbrechung der Lösung sinkt, die Bakterienmasse wird im allgemeinen erhöht (C. Siebenmann (314)); später erzeugt die auftretende Autolyse eine merkliche Bakterienmasseabnahme, die von einer Ammoniakbildung und Alkalisierung des Mileus begleitet ist. Der Amino- saure-N wird erhöht nach einer kurzdauernden Abnahme im Anfänge der Bebrütung (O. Hida und S. Suzuki, 1. c.); auch die mit Tannin bzw. Alkohol fällbaren N-Frak- tionen erleiden eine Erhöhung. Humin- und Zystin-N nehmen dagegen ab. Sie werden wahrscheinlich in die Bakterienzellen eingebaut. 2. Toxinreinigung Das in synthetischen, sowie in gewöhnlichen Medien gebildete Diphtherietoxin be- findet sich in einem sehr komplizierten Gemisch von verschiedenen Bestandteilen des Nährbodens, zu denen sich noch die mannigfaltigen Stoffwechselprodukte der Diph- theriebakterien und Substanzen aus ihren abgestorbenen und autolysierten Leibern hinzugesellen. Für die Erforschung der chemischen Natur des Toxins, sowie für die Herstellung hochaktiver Schutzimpfstoffe wurde es als besonders dringendes Bedürfnis empfunden, die Toxine möglichst von allen diesen Ballaststoffen zu befreien, und da- durch zu reinen Toxinpräparaten zu gelangen. Bei der Anwendung von verschiedenen physikalischen und chemischen Reinigungs- verfahren wurden einige Veränderungen der toxischen und antigenen Toxinfunktionen beobachtet. Diese Veränderungen wurden manchmal von gewissen chemischen Vor- gängen begleitet, die unsere Anschauungen über die Struktur und Wirkungsgruppen des Toxinmoleküls bereicherten. Unsere Kenntnisse auf diesem wichtigen Gebiet der Diphtherie-Toxinforschung sind noch ziemlich lückenhaft; die schon erzielten Resultate gestatten aber, gewisse Aussagen über die Chemie des Diphtherietoxins zu machen. a) Physikalische Reinigungsmethoden. Von den physikalischen Methoden der Toxinreinigung wurde besonders die Uitra- filtration der toxinhaltigen Diphtheriekulturen öfters herangezogen. S. Sierakowski und R. Zajdel (381, 382), sowie Sbarski und Nikolajeff (372) trennten das Diphtherie- 49 toxin mit Hilfe der Ultrafxltration durch 3 °/o Kollodiummembranen von Bakterien und Albuminen ab. Danach filtrierten sie die erhaltene Lösung durch 10% Kollodium- membranen bei 5 °, die das Toxin zurückhielten. Nach Abspülung mit NaCl-Lösung wurde das Toxin mit einem Azetatpuffer bei ph = 4,8 ausgefällt. Nach wiederholter Auflösung in 0,1—n NaOH und Wiederausfällung mit Azetat bei 0 0 gewannen sie ein gereinigtes Präparat, das frei von Albumosen und Aminosäuren war und sehr wenig Mineralbestandteile enthielt. Das Präparat besaß typische toxische, serologische und antigene Eigenschaften des Diphtherietoxins. A. Wadsworth und J. J. Quigley (387) fanden die Bechholdschen Ultrafilter als zu wenig ergiebig und schlugen ihre eigene Apparatur vor. Mit den 4,5—11 % Kollodium- membranen erhielten sie praktisch das ganze Toxin aus 4 Liter Toxinlösung in ge- reinigter Form; der Gesamt-N-Gehalt wurde dabei um 94 % vermindert, die Toxizi- tätsverluste traten nicht auf. Später (Wadsworth, Wheelen und Mendez (388)) haben sie die 8,5 % Parlodionmembranen mit Erfolg zur Ultrafiltration eines halbsyntheti- schen Toxinnährbodens herangezogen. Mit Hilfe der Quigleyschen Apparatur erhielten auch F. Modern und G. Ruff (362) ein stickstoffarmes Toxin, dessen Toxingehalt auf das 3—12fache gegenüber dem un- gereinigten anstieg. C. Russo (370) fand ebenfalls, daß die Ultrafiltration die physi- kalisch-chemischen, serologischen und biologischen Eigenschaften des Diphtherietoxins unverändert läßt. Er empfiehlt auf die Klarheit, Viskosität und den pH-Wert der Toxinlösungen bei ihrer Ultrafiltration besonders zu achten. Weiterhin wurde von den physikalischen Verfahren noch die Elektrophorese der toxinhaltigen Lösungen versucht (H. Theorell und G. Norlin (386)). E. M. Maver (361)) erzielte mit dieser Methode beim Diphtherietoxoid einen Reinheitsgrad, bei dem 1 Lf in 0,00555 mg. Trockensubstanz = 0,0009 mg. N erhalten wurde. Toxin wandert im elektrischen Felde gemeinsam mit Bakterienproteinen und ist gleichzeitig mit ihnen durch Pepsin, Papain und alkalisches Trypsin zerstört. Durch Ausfrierung bei —50 lassen sich bei den Diphtherietoxinlösungen nach A. Salimbeni und G. Loiseau (371) drei Fraktionen abtrennen. Die erste, sehr dicke und flüssigbleibende enthält fast das ganze Toxin. Eis ist toxinfrei, enthält aber in seinen Lücken die dritte, leicht gefärbte, sehr toxinarme Fraktion. Oberhalb des Gefrier- punkts herrscht ein sehr stabiles Gleichgewicht zwischen dem Lösungsmittel und den in ihm gelösten Stoffen, so daß das Gemisch schwer trennbar ist. b) Chemische Reinigungsmethoden. 1. Säurefällung. Die Säurefällung als Methode der Toxinreinigung wurde zuerst von Gienny und Walpole (338) vorgeschlagen. In der Folgezeit versuchten Watson und Mitarbeiter (389, 390), Locke und Maine, Koulikoff und Smirnow (353) diese Methode zu vervollkommnen und in die Praxis einzuführen. Im Jahre 1928 haben D. Kissin und L. Bronstein (352) beim Zusatz von Mineralsäuren (besonders der 1-n HCl) zum Diphtherietoxin das Auftreten von drei Phasen im Verlaufe der Ansäuerung be- obachtet. Die erste Phase, die sich bis zum Erreichen von pH = 6,2—6,3 erstreckt, ist die Phase der Neutralisation der Bikarbonate des Nährbodens. Nachdem, dieser Punkt I erreicht ist, kommt es bei weiterem Säurezusatz zur Bildung eines Nieder- schlags, der praktisch das gesamte Toxin enthält und bei Healkalisierung sich wieder auflöst. Dabei treten keine größeren Toxinverluste auf, und die Flockungsfähigkeit bleibt fast intakt. Auf dem Höhepunkt der Niederschlagsbildung wird Punkt II er- reicht (isoelektrischer Punkt der Toxinproteine). Bei weiterer HCl-Zugabe löst sich der Niederschlag auf und nachdem alles aufgelöst ist und die freie HCl (Tropäolin als Indikator) erscheint ist der Punkt III eingetreten. Wenn man die zur Erreichung der betreffenden Punkte notwendigen HCl-Mengen mißt, kommt man zu dem sog. „Säure- quotient“ (II—I) : (III—II). Er ist für die geprüften Toxine konstant und beträgt für frische Toxine im Mittel 1 ; 2, nähert sich für die gealterten aber dem Wert 1 : 1. 50 Dieses Verhalten des Toxins den Mineralsäuren gegenüber wurde durch eine Mo- dellvorstellung über die Toxinstruktur erklärt, wonach das Toxin ein höheres Poly- peptid ist, bei dem pro eine freie COOH-Gruppe zwei freie Aminogruppen entfallen müssen, und zwar je eine primäre und eine tertiäre. Die Säureausfällung des Toxins wird durch die Herabsetzung der Dissoziation der COOH-Gruppe, die Wiederauflösung bei weiterem HCl-Zusatz durch Bildung von Chlorhydraten der Aminogruppen des Toxins erklärt. Mit Alterung des Toxins soll eine innere Anhydrisierung des Toxin- Polypeptids mit Bildung eines laktamartigen NH-CO-Rings eintreten, die das HC1- Bindungsvermögen herabsetzen muß. Ist die Toxizität des Toxins mit der Anwesen- heit von freien Aminogruppen verknüpft, könnte dieses Toxinmodell auch die Toxizi- tätsabnahme bei Alterung des Toxins erklären. Beim Altern des Toxins wird aber, vermutlich, nur ein Teil der Aminogruppen der Fähigkeit, HCl zu binden, schnell entzogen. Dieser Teil wird mit der Zeit allmäh- lich vergrößert auf Kosten von freien Aminogruppen. Beim Formolisieren des Toxins wird ebenfalls nur die primäre Aminogruppe gebunden, die tertiäre aber bleibt intakt. Diese Hypothese über die chemische Struktur des Diphtherietoxins wurde in der Folgezeit besonders von Hewitt (417) heftig kritisiert. Sie enthält aber viele Punkte, die u. E. auch jetzt ihre Bedeutung nicht verloren haben. Wir kommen auf dieses Thema bei der Besprechung der Formolinaktivierung des Diphtherietoxins zurück. Obwohl W. E. Bunney, J. Cianciarullo und M. Kiamil (331) die Säurereinigung, kombiniert mit der Alkoholfällung im großen Stil erprobt und für die industriellen Zwecke als geeignet gefunden haben, hat sich diese Methode in der Praxis nicht durch- setzen können wegen der zu großen Verluste an der antigenen Wirksamkeit der er- haltenen Präparate. So fanden, z. B. S. Schmidt und Kjaer (378, 379), daß die durch Adsorption am Al (OH)3 und Säurefällung gereinigten Toxine nicht nur hitzeempflnd- licher werden (das werden sie auch nach anderen Reinigungsmethoden), sondern bei 37 ° in 24 Stunden etwa 30 % ihrer Toxizität und Flockungseigenschaften einbüßen. Damit geht auch ein Teil ihrer antigenen Wirksamkeit verloren. . Trotzdem bedienen sich auch in der neuesten Zeit einige Laboratorien der Säure- fällung bei der Toxinreinigung mit Erfolg. J. Rubinstein, S. Ssosina und G. Rachmant- schik (369) berichten über günstige Resultate, die sie besonders mit HCl bei pH = 3,8 bei der Toxinreinigung erzielten. Essigsäure ist auch brauchbar. Dabei erhalten sie das bis zu 95—97 % von den Ballaststoffen befreite Diphtherietoxin, das noch 91—96 % seiner antigenen Wirksamkeit besitzt. A. Boivin und Y. Izard (328) haben ihre bei der Gewinnung von Endotoxinen der gramnegativen Bakterien gut bewährte Methode der Trichloressigsäurefällung (in der Kälte bei pH = 3,5) auf die Reinigung des Diphtherietoxins zu übertragen versucht. Sie erreichten damit eine Reinigung von den Ballaststoffen bis zu 99 %. Der erhaltene Toxinniederschlag wurde (Boivin (329)) im Phosphatpuffer oder in 0,1—n Na2C03 bei pH = 8 aufgelöst, mit Tierkohle entfärbt und erneut mit Trichloressigsäure gefällt. Es wurde dabei bis zu 75 % des Toxins zurückgewonnen. Das gereinigte Toxin hatte eine antigene Wirksamkeit, die einer Lf = 0,003 mg Substanz entsprach. Es enthielt 15,1% N; 0,1% P; 0,5% Aschespuren von Fe, aber kein Cu. Es gab die Farbreaktionen auf Proteine; die Molisch-Reaktion war negativ. Nach der Säurenhydrolyse wurden keine Fettsäuren, keine Kohlehydrate, keine Purin- basen, nur aber die Aminosäuren gefunden. Aus den Ergebnissen der Säurefällung des Diphtherietoxins wurden einige weitere Einblicke in die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Toxinteilchen gewonnen. Das Diphtheriegift soll ein Ampholyt sein, das bei pH = 3—4 maximal ausgefällt wird. Seine Toxizität ist an seine Eigenschaften als Säure gebunden, da das pH-Optimum der Toxingiftigkeit bei pH = 8—9 liegt. Die untere und obere pH-Grenze der Toxi- zität liegen bei pH = 5 bzw. 12. Das Antitoxinbindungsvermögen verhält sich in einer analogen Weise (v. Groeer (345)). Bankin und Mitarb. (327) wollen diese pH-Zone 51 der Toxingiftigkeit auf das Intervall zwischen pH = 5,5 bis 9,5 einengen. Bei einer stärkeren Säuerung der Toxinlösung wird das durch die vorherige pH-Erniedrigung ungiftig gewordene Toxin teilweise wieder giftig. Die Verluste an Toxizität bei Aus- säuerung sind von reversibler Natur und verlaufen parallel der Verminderung seines Dispersitätsgrades (siehe auch Raewsky (368)). Nach Kulikow und Smirnow (355), sowie Sedailian et Gaumout (380) liegt der isoelektrische Punkt des Diphtherie-Bouillontoxins bei pH = 4.7— 4.8. Der bei diesem Punkte erhaltene Toxinniederschlag ist phosphorreicher; er ist pepsinoresistent und soll aus Nukleoproteinen bestehen. Nach Dialyse verliert er seine toxischen und anti- genen Eigenschaften. Hallauer (347) nimmt als Grundlage der Toxininaktivierung durch Säure eine re- versible intramolekulare Umlagerung der die Toxizität bedingenden Ringstrukturen des Toxinteilchens zu offenen Ketten an. Bei der Realkalisierung wurden die Ringe wieder geschlossen und die Toxizität wieder hergestellt. Ganz vereinzelt in der Literatur stehen die Befunde von Krestownikowa, Rjachina und Petrowa (354). Diese russischen Forscherinnen haben das Diphtherietoxin durch Ultraflltration, Dialyse und Alkoholfällung gereinigt. Danach folgte eine Fraktio- nierung mit Trichloressigsäure. Die säurelösliche Fraktion T war toxisch, eiweißfrei und mit Phosphorwolframsäure fällbar. Die Niederschlagsfraktion S lieferte nach Hydrolyse Zucker und freie Purinkörper, sowie einen abtrennbaren „Aminoanteil“. Die Eiweißkomponente für sich wirkte nicht antigen und präzipitierte nicht mit dem spezifischen Antiserum. Nur beide Fraktionen zusammen besaßen die volle antigene und serologische Wirksamkeit. Diese Befunde wurden von anderen Autoren nicht kritisch überprüft und scheinen größtenteils durch unzulängliche Arbeitstechnik bedingt zu sein. 2. Adsorptionsmethoden. In Anlehnung an die bei der Fermentreinigung durch R. Willstätter und Mitarb. ausgearbeitete Methodik der Adsorption der Zellwirk- stoffe am Aluminiumhydroxyd wurden die entsprechenden Toxinreinigungsverfahren entwickelt. E. Maschmann, E. Küster und W. Fischer (360) fanden, daß das ß-A\ (OH)-j das Diphtherietoxin in schwach saurer Lösung am besten adsorbiert. Nach einer Ein- stellung auf pH = 5,5 mit Essigsäure setzten K. Linderström-Lang und S. Schmidt (356—358), sowie A. Hansen und S. Schmidt (348) den Toxinlösungen das Aluminium- hydroxyd C y hinzu. Nach dem Zentrifugieren und Waschen des Niederschlags mit destilliertem Wasser wurde das Toxin im 0,1—n Na2HPC>4 eluiert. Es folgte Dialyse und wiederholte Adsorption und Elution im Vakuum und in der Kälte. (Siehe auch S. Schmidt (374, 375)), sowie S. Schmidt und A. Hansen (376, 378)). Bei dieser Prozedur wird das Toxin von 99,5 (Vo seiner Ballaststoffe gereinigt. Die Toxizität nimmt etwas ab, die antigene Wirksamkeit und die Fähigkeit, mit dem Anti- serum spezifisch auszuflocken, bleiben aber unverändert. Als Ausdruck dieser Verände- rungen nimmt die Toxizität pro mg N, besonders aber der Antigenwert in AE pro mg N bedeutend zu. C. G. Pope und F. V. Linggood (367) kombinierten die Toxinadsorption am Al (OH):5 mit Ultrafiltration und Holzkohlebehandlung. Dadurch wird das Toxin bis auf ge- ringe Spuren von Bakterienproteinen befreit. Fast 100 °/o des Gesamtproteins liegt nach dieser Behandlung als reines Toxin vor. Das Bakterienprotein ist besonders durch seine Hitzekoagulierbarkeit bei pH — 4 ausgezeichnet. Von anderen Metallhydroxyden wurden zwecks Toxinreinigung noch Zn(OH)2 und Mg(OH)2 verwendet. Zinkhydroxyd wurde von S. Ohyama (363) eingeführt. Das ge- reinigte Toxin war zuckerfrei, thermolabil, frei von bakteriellem Eiweiß, empfindlich gegen Trypsin und hatte, verglichen mit dem Rontoxin eine doppelte Toxizität. Auch Cas (P04)2 gibt gute Resultate (Abt (325)). 52 Die Adsorption des Diphtherietoxins an Mg (OH)2 in kolloidaler Suspension wurde noch von P. Groß (346) untersucht. Es wurden bis 94 °/o des Toxins adsorbiert. Die Elution geschah mit Hilfe des Ammoniumphosphats oder durch C02-Einleitung. Durch Dialyse von Magnesium- und Ammoniumionen befreit, ergab sich als Endergebnis ein Toxin, das von 90 °/o der Begleitstoffe befreit war; ein Dlm dieses Toxins war in 0,0037 ccm der gereinigten Lösung enthalten. Da vor der Adsorption Dlm = 0,0035 ccm war, waren bei diesem Verfahren keine Toxizitätsverluste zu verzeichnen. E. E. Ecker und L. A. Weed (336) vervollkommneten diese Methode und verringerten den Mg(OH)2-Verbrauch bis auf ein Zehntel des früheren Wertes. Endlich erzielten K. Ando und T. Komiyama (326) ein gutgereinigtes Produkt, indem sie das Toxin an Calcium- phosphat in Kombination mit dem Zinkhydroxyd adsorbiert hatten. Bei der Adsorption an Kohle bleibt die Giftigkeit der Di- und Tet.-Toxine unvermindert. Sie vermögen aber im adsorbierten Zustande viel weniger Antitoxin zu binden (Eisler (337)). 3. Fällung mit Alaun, Ammoniumsulfat u. ähnl. Die meisten der bisher bespro- chenen Verfahren wurden in der Absicht entwickelt, möglichst reine und hochwirk- same Impfstoffe zu erhalten. Aus diesem Grunde wurde dabei viel mehr Aufmerk- samkeit der Reinigung der Toxoide, als der eigentlichen nativen Toxine geschenkt, sowie viel mehr Wert gelegt auf die Veränderungen der biologischen und serologischen Eigenschaften der gewonnenen gereinigten Produkte als auf ihre chemische Struktur. Tn Verfolgung dieser praktischen Aufgaben versuchten E. T. Glenny und M. Barr (339) das Diphtherie-Formoltoxoid mit Alaun auszufällen. Je nach dem Gehalt an Alaun, das in der zu reinigenden Toxinlösung bzw. im Formoltoxoid erzielt wurde, entstanden dabei verschiedene Produkte. Bei höheren Alaunkonzentrationen wurden die Antigenverluste größer, der Reinigungsgrad des Produkts stieg aber an. (Siehe auch Wells, Graham und Hävens sowie Hävens und Wells (350)). A. Tasman und A. Bondman (383) verglichen die Methode der Alaunfällung (später benutzten sie Ammonium — anstatt des Kalialauns) des Diphtherietoxins mit seiner Adsorption an Al(OH)3. Sie fanden, daß die Adsorptionsmethode qualitativ bessere Präparate ergab, die mehr Dlm pro 1 mg N enthielten. Die Verluste an antigener Wirksamkeit waren aber bei dem letzten Verfahren größer als bei der Alaunfällung (es wurden nur bis 66 °/o Antigens zurückgewonnen). Deshalb gingen sie später zur Ausfällung des Toxins mit Ammoniumsulfat (330, 384, 385) über. Sie fällten das Toxin bei pH = 8,0—8,7 mit 26,5—45 °/o des Ammoniumsulfats aus. Wenn das Rohtoxin ei- weißarm und die Sättigungszone eng genug gewählt wurde, gewann man ein beträcht- lich eiweißärmeres gereinigtes Toxin. Bei einer Ausbeute an gereinigtem Toxin von 50—60 % des Rohtoxins erzielte man eine bis zu 30fache Vergrößerung der antigenen Wirksamkeit pro mg N. Durch Dialyse wurde das gereinigte Toxin salzfrei gemacht. M. D. Eaton (332, 333) verglich zwei der früheren Toxinreinigungsmethoden unter- einander (Säurefällung 4 Ammoniumsulfatfraktionierung und Ammoniumsulfatfrak- tionierung + Adsorption am Aluminiumhydroxyd) und, da er sie beide unbefriedigend fand, arbeitete er ein neues Verfahren aus. In einem fleischwasserfreien Peptonnährboden nach Wadsworth und Wheeler hat er zuerst die Phosphate mit CaCl2 ausgefällt. Dann fällte er die Proteine mit Am- moniumsulfat (Vs-Sättigung). Danach kam eine Toxinausfiockung mit Ammonium- alaun bei pH = 6. Nach dem Auswaschen des Niederschlags wurde er in Na-zitrat ge- löst und mit Kadmiumchlorid wiederholt ausgefällt. Aus 100 Liter Rohtoxins gewann er in dieser Weise 1—2 gr gereinigten Toxins, das pro 1 Lf etwa 0,0005 mg N und pro 1 Dlm — etwa 0,000016—0,00002 mg N enthielt. Das Verhältnis Dlm : Lf betrug 20—35. Das Präparat enthielt außer dem Protein, das mit dem Toxin wahrscheinlich identisch ist (nicht weniger als 80 °/o des Gesamteiweißes des gereinigten Toxins ist durch Trichloressigsäure fällbar), noch die Spuren von Proteosen aus dem Nährboden und wahrscheinlich Spuren von bakteriellem Eiweiß. Nach Hydrolyse wies das ge- reinigte Toxin die Anwesenheit von beträchtlichen Mengen von Tyrosin und Arginin 53 auf, vielleicht auch von Phenylalanin und Histidin, dagegen sehr wenig Tryptophan und keinen Zystin-Schwefel. Es besitzt unter 0,5 % P. Molisch-Reaktion war negativ, oder nur sehr schwach positiv. Weiterhin (334) befreite Eaton das gereinigte Toxin von den noch vorhandenen Spuren der Fremdproteine durch Säurefällung. Er benutzte dabei als Fällungsmittel: Nukleinsäure, H3PO4 oder H2SO4. Nachfolgend hat er mit Ammoniumsulfat fraktio- niert. Dabei wurden auch die Reste von Proteosen und Peptonen entfernt. Bei solcher Reinigung geht aber rund die Hälfte der Toxizität verloren; gleich- zeitig verschwindet auch die präzipitinogene Wirkung des gereinigten Toxins. Die Frage, ob durch die Säure auch das Toxin mitausgefällt wird, beantwortet Eaton da- hin, daß natives Toxin in Anwesenheit von ganz kleinen Elektrolytmengen durch An- säuerung nicht ausfällbar sei; was dabei ausflockt muß das denaturierte Toxin sein. Gleichzeitig wird durch das koagulierte Eiweiß das etwa in dem Nährboden verhan- dene Porphyrin mitgerissen und in dieser Weise vom gereinigten Toxin abgetrennt. In einer späteren Arbeit (335) gibt Eaton ein verbessertes Toxinreinigungsverfahren an, bei dem die Alaunfällung weggelassen ist. Die Toxinlösung, die 2 % Na-zitrat ent- hält, wird bei pH = 7,0 mit Vs Volumen der 5 °/o CdCl2-Lösung versetzt. Nach 1—2 Stunden wird der Niederschlag abfiltriert und das Filtrat bei pH = 6,0 zu Vs Volumen mit 5 °/o Kadmiumchloridlösung versetzt. Nach dem Absetzen im Eisschrank über Nacht wird der Niederschlag mit dem Phosphatpuffer gewaschen und dann bei pH = 7,8 eluiert. Weiter folgt eine Ammoniumsulfat-Fällung. Dialyse-Auflösung und Säure- fällung. Auf diesem Wege bekam Eaton ein Toxin, das genau wie das Präparat von Boivin 1 Lf in 0,003 mg Trockensubstanz enthielt (0,01 mg—1 AE). Aus einer halbsynthetischen Nährlösung haben A. M. Pappenheimer und S. J. Johnson (294) mit Ammoniumsulfat ein gereinigtes Toxinpräparat hergestellt, das 1 Lf in 0,00046 mg N, 1 Dlm in 0,0000125 mg N enthielt. 1 Lf war wiederum in 0,003 mg Trockensubstanz enthalten. Dieses Präparat (2) ergab bei Analyse 16 % N, 0,75 % S, 9 °/o Tyrosin, 1,4 % Tryptophan. Nach den Analysen eines später gewonnenen Prä- parats (364) des Diphtherietoxins, wurden in ihm 2,3 °/o Histidin, 3,8 °/o Arginin und 5,3% Lysin gefunden. Es hatte eine spezifische Drehung — = —40° und einen isoelektrischen Punkt bei pH = 4,1. Die Teilchengröße des gereinigten Toxins wurde mit Hilfe der Elektrophorese, Sedi- mentation in der Ultrazentrifuge und Diffusion gleich 72.000 gefunden, die des Diph- therieantitoxins aus Heilserum = 150.000 (359, 365). Pappenheimer und M. L. Peter- mann (366) haben für das Diphtherietoxin folgende wichtige physikalisch-chemische Konstanten gemessen: Das Toxin ist zwischen pH = 5,6 und 10,0 stabil. Seine Sedimentationskonstante = 4,6 . 10"3. Seine Diffusionskonstante — Dgo» = 6,0.10 ~7. Die Teilchengröße = 74.000. Die elektrophoretische Beweglichkeit = 4,9 . 10“5. Das Verhältnis der Achsen des Toxinteilchen = a : b = 4,7. Das Toxin hat ein Maximal,,valenz“ für das Antitoxin = 8; die des Anti- toxins für das Toxin ist gleich 2. 4. Andere Reinigungsmethoden. Es wurden noch einige Fällungsmethoden zur Toxinreinigung herangezogen, die aber keine größere Anwendung fanden. So ver- suchten A. Hansen und S. Schmidt (349) durch Mischung des Diphtherietoxins mit Methanol im Verhältnis 1:9 in der Kälte seine Reinigung zu erzielen. Es tritt aber eine deutliche Abnahme der Toxizität und des Flockungsvermögens, sowie in klei- nerem Maß der antigenen Wirksamkeit ein. Aethanol greift weniger das Toxin an, reinigt es aber nicht so gut wie Methanol. Mit der Azetonfällung haben sie ebenfalls keine guten Resultate erzielt. 54 H. Goldie (340, 341) untersuchte eine Reihe von organischen Verbindungen auf ihre Fähigkeit, das Diphtherietoxin ohne größere Schädigungen auszufällen. So erzielte er eine schnelle Reinigung durch Ausflockung des Toxins mit einer zitronensauren Lö- sung des p-Aminophenylstibinats (1), mit nachfolgendem Waschen des Niederschlags in 2—4°/oiger Lösung des 1-Amininaphthalin — 4, 6, 8 — Na-trisulfonats, womit auch die Reste des Antimons entfernt wurden. Auch mit geringen Mengen von p-Azetyl- aminophenyl-Na-arsinats konnte er in verdünnten Toxinlösungen einen krümmeligen Toxinniederschlag erzeugen. Die toxinfällende Fähigkeit der organischen Sb- und As- Verbindungen erwies sich als von der Anzahl und Stellung gewisser Gruppen am Benzolkern stark abhängig. Weder merkliche Verluste der Toxizität noch die der anti- genen Wirksamkeit wurden dabei beobachtet. Auch mit dem 2-Aminonaphthol — 3, 6, 8 — Na-trisulfonat erzielte er gute Ausbeute am hochgereinigten Toxin (343, 344). Die oben mitgeteilten Erfolge auf dem Gebiet der Reindarstellung und der physi- kalisch-chemischen Erforschung des höchstgereinigten Diphtherietoxins lassen keinen Zweifel bestehen, daß es sich bei diesem Wirkstoff um ein spezifisches Protein handelt, dessen Teilchengröße der des Haemoglobins sehr nahekommt. Es fällt ein relativer Reichtum an aromatischen Aminosäuren, sowie an basischen Aminosäuren, besonders am Arginin auf. Der letzte Umstand im Zusammenhang mit der bei der Säuredena- turierung sowie bei der Formol- und Ketenentgiftung festgestellten Wichtigkeit der freien Aminogruppen für die Toxizität dieses Wirkstoffs, könnte als vielversprechen- der Hinweis für die zukünftigen Versuche zur Aufklärung des Wirkungsmechanismus, sowie der Konstitution der Wirkgruppen des Diphtherietoxins betrachtet werden. 3. Toxinentgiftung Es ist bisher keine rein physikalische oder chemische Toxinnachweismethode be- kanntgeworden. Dadurch sind wir auch jetzt gezwungen, das Diphtherietoxin nur auf Grund seiner biologischen Eigenschaften zu identifizieren und zu dosieren. Das Toxin zeichnet sich durch folgende biologischen Partialfunktionen aus: seine Giftigkeit für Warmblütler und seine antigene Wirksamkeit, sowie durch seine Fähigkeit bei Einhal- tung gewisser Milieubedingungen t°, pH, Elektrolyten) und Mengenverhältnisse der beiden Partner mit einem Diphtherie-Immunserum spezifische Flockung zu geben. Jede dieser Teilfunktionen ist sicher durch gewisse physikalische und strukturchemische Eigenschaften der Toxinteilchen bedingt. Dabei scheint die Toxizität mehr mit ge- wissen, wahrscheinlich ziemlich scharf begrenzten Stellen des Toxinteilchens ver- knüpft zu sein, während die antigene Wirksamkeit, sowie zum Teil auch die Flockungs- fähigkeit mehr durch kolloidchemische Eigenschaften des Toxinmoleküls als Ganzem beeinflußt werden, natürlich aber auch von den die Toxinspezifität bedingten chemi- schen Strukturen abhängig sein müssen. Diese Partialfunktionen des Diphtherietoxins werden durch einige chemische Sub- stanzen verschieden stark angegriffen. Man kann die Toxizität zum Verschwinden bringen, während seine Ausflockbarkeit durch das spezifische Antiserum und die antigene Wirksamkeit erhalten bleiben. Die Dissoziation der Partialfunktionen des Diphtherietoxins mit Hilfe einiger chemischer Substanzen liegt der ganzen Produktion der nicht toxischen Schutzimpfstoffe zugrunde. In der Tabelle IV geben wir einen Überblick über die durch verschiedene chemi- sche Substanzen am Diphtherietoxin hervorgerufenen Veränderungen der Toxizität und seiner antigenen Wirksamkeit wieder. 55 Tabelle IV Agens Wirkung auf Toxizität Antigene Schrifttum 1. Kohlenwasserstoffe aliphatische 2. Kohlenwasserstoffe aromatische 3. Halogenderivate aliphatische 4. Halogenderivate aromatische (im Kern) 5. Halogene in Seitenketten d. aromatischen Kohlen- wasserstoffe 6. Nitro- u. Aminoderivate aromatische Keine Keine Bisweilen vernichtende Keine Zerstörende Zerstörende S. Schmidt (454, 455, 460, 461, 462) 7. Alkohole aliphatische: Methanol Keine Abschwächende S. Schmidt (458); Aethanol Keine Abschwächende S. Schmidt und C3, C4 und C9—C1G Keine H. Hansen (349) C5 und C6 Starke zerstörende C7 und C8 Schwache zerstörende 8. Phenole Zerstörende 9. Aldehyde: Formaldehyd Siehe Text Acetaldehyd Schnell Langsam S. Schmidt (455, 457); . zerstörende zerstörende A. Berthelot und C3 und höhere Aldehyde Zerstörende G. Ramon (394) Aromatische Aldehyde Zerstörende Furfurol Chlorierte aliphatische Schnell Langsam zerstörende zerstörende Aldehyde Starke zerstörende Azetale Keine 10. Aethyläther Zerstörende S. Schmidt (458) 11. Ketone: S. Schmidt und Azeton Keine H. Hansen (349); Methyläthylketon Keine Schwach A. Wadsworth u. a. (479) zerstörende 12. Carbonsäuren: Gesättigte ab von C5 Starke zerstörende Halogenierte Säuren Noch stärkere Wirkung S. Schmidt (459) Oxysäuren Starke zerstörende Glyoxylsäure Keine oder fast keine S. Schmidt (457) Fumar- u. Maleinsäure Keine Ölsäure Hüllenbildung Keine W. Larson u. a. Ricinolsäure Zerstörung Keine (424, 425) Natriumoleat Fast keine M. Bayliss (484) Andere Seifen Hüllenbildung, Keine Nelis (440) dann Zerstörung 13. Glucose Keine oder fast keine S. Schmidt (457) 56 Agens Wirkung auf Toxizität Antigene Schrifttum 14. Lipoide; Sterine (Lanolin) Galle Abschwächende Keine Keine Eisler und Gottdenker (401) Smith u. ä. (463) 15. Keten Siehe Text 16. Salvarsan, Germanin Ab schwächende H. Goldie (342, 409, 410) 17. Sulfonamide: Diazosulfanilsäure Sulfanilamid Ab schwächende Keine Fast keine Keine Michelazzi (437) 18. Salizylsäure Oxynaphtholsäure Abschwächende Keine Abschwächende Keine K. E. Birkhaug (395) H. Vincent (476) H. Vincent und L. Velluz (477) 19. Redoxkörper Ascorbinsäure, Glu- tathion, Adrenalin Siehe Text Dopa, Bilirubin, Homo- gentisinsäure, Ab sch wächende . /. L. Velluz (474) Redoxindikatoren Zerstörende ./. F. C. Lin (431); P. Moloney und E. Taylor (438) 20. Metalle; Kupfer Abschwächende ./. Laubenheimer (426); Baumgartner und Luger (393) Kolloidale Fe und Mn Abschwächende ./. Le Fevre de Arric (427) Goldorgan. Verbind. Zerstörende Grasset (411) 21. Schwefelkörper Kolloidaler S Zerstörende L. Velluz (472); Scaglioni (450) Schwefelkohlenstoff Keine R. Agnoli (391); G. Rossi (448) 22. Fermente: Trypsin Zerstörende N. Ray (447) Papain Zerstörende L. Velluz (473) Takadiastase Andere Diastasen Lipase Zerstörende Keine Keine Y. Anazawa (392) 23. Andere Mikroben: B. pyocyaneus Abschwächende ./. Duchon (400) B. coli, cereus, proteus, sporogenes Abschwächende ./. Stark, C. N., Stark, P. und Sherman, J. M. (468) 24. Tetanustoxin Gegenseitig abschwächende ./. Marinelli (436) 25. Ultraviolettes Licht Abschwächende ./. Welch und Megrail (481) 26. Ultraschall Ab schwächende ./. Kasahara und Takagi (420) 57 Aus dieser Zusammenstellung ersieht man, daß, außer den rein physikalisch chemischen Einwirkungen (Seifenhüllenbildung, Adsorption, Strahleninaktivierung) die Toxizität des Diphtherietoxins besonders gegenüber folgenden chemischen Kör- pern empfindlich ist; 1. selektiv — gegenüber den — CHO-Gruppen (Aldehyde, Glukose) — Methyleni- sierung der freien Aminogruppen und gegenüber dem Keten-CHo . CO — deren Azetylierung; 2. gleichzeitig mit der antigenen Wirksamkeit gegenüber allen stärker elektro- negativen, ausgesprochen heteropolaren Verbindungen (Carbonsäuren, Halogenderi- vate der aliphatischen und aromatischen Kohlenwasserstoffe, Phenole, Nitrover- bindungen. Außerdem ist das Diphtherietoxin als Ganzes gegenüber den starken Mineral- säuren und -Alkalien, sowie den oxydierenden und reduzierenden Mitteln (Redox- indikatoren, körpereigene Wirkstoffe) und einigen Enzyinen empfindlich, was mit seiner labilen Proteinnatur im Zusammenhang stehen muß (siehe z. B. O. Löwy (433), de Potter (446), Nells (439), S. Schmidt (456) u. a.). Wegen ihrer praktischen Bedeutung (Herstellung von Formoltoxoiden), aber auch wegen gewisser mit diesen Fragen eng verbundenen theoretischen Erwägungen wollen ■wir die Probleme der Formalin- und Ketenentgiftung etwas eingehender behandeln. Die Formal inentgiftung wurde zuerst von Glenny und Sudmersen (406) auf das Diphtherietoxin angewandt. Die entgiftende Wirkung des Formalins auf das Diph- therietoxin hat eigentlich schon Salkowski (449) festgestellt, ohne aber die gleich- zeitige Erhaltung der antigenen Funktion zu berücksichtigen. Das Verfahren ist später besonders durch die Arbeiten der Schulen von Glenny, G. Ramon, S. Schmidt u. a. weiter ausgebaut und eingehend erforscht worden. Es gibt deutliche Unterschiede zwischen einer „natürlichen“ (etwa durch Alterung. Säureeinwirkung u. a. hervorgerufenen) Umwandlung des Toxins in ein atoxisches Toxoid (im Sinne Ehrlichs) und der Bildung eines Formoltoxoids (oder Anatoxins) nach längerer Formalineinwirkung. Die Bildung der „natürlichen“ Toxoiden ist wenigstens teilweise umkehrbar. Bei den durch Erhitzung erhaltenen Toxoiden erlaubt die Aufbewahrung bei niederer Temperatur eine teilweise Wiedergewinnung der Toxizität zu erzielen (S. Schmidt (452). Auch die durch Säure inaktivierten Toxine können durch Realkalisierung ihre Toxizität zurückgewinnen. Besonders interessant ist in dieser Hinsicht die Beobach tung von H. Schmidt und S. Scholz (451), wonach die durch Alterung entstandenen Toxoide durch Zusatz von Pepton bzw. peptonhaltiger Bouillon die Eigenschaften de? echten Toxins wiedererlangen können. Durch die Erweiterung und Abänderung der Versuchsbasis gegenüber den älteren Versuchen von Walbum, konnten H. Schmidt und S. Scholz ihre Auffassung über die Neubildung des Toxins auf Kosten der fermentativen Umwandlung des zugesetzten Peptons ablehnen, und das ganze Phä- nomen durch die Reversibilität der Reaktion Toxin — Toxoid erklären. Demgegenüber sind die Formoltoxoide völlig irreversibel. Wenigstens ist es bis heute keinem gelungen (mit Ausnahme einer einzelnen, leider nicht reproduzierbaren Beobachtung von H. Schmidt (258, S. 458). das Formoltoxoid wieder toxisch zu machen. Außerdem unterscheiden sich die Formoltoxoide von den „natürlichen“ Toxoiden und nativen Toxinen durch ihre erhöhte Resistenz gegenüber Wärme, Säuren, Alkalien und verschiedenen chemischen Verbindungen (S. Schmidt (453)). Der Formalinentgiftungsvorgang wird durch Erhöhung der Formalinkonzentra- tion, der Temperatur und des pH-Werts des Milieus (Optimum bei pH = 8,0—8,5) be- schleunigt. Toxine, deren Gehalt an Aminostickstoff hoch ist, brauchen mehr Formaldehyd zu ihrer Entgiftung als die aminostickstoffärmeren (Glenny, Hopkins, Pope (405)). Dialy- 58 sierte Toxine (sowie die überhaupt gereinigten) werden schneller und von kleineren Formalinkonzentrationen entgiftet (Nelis (441), S. Schmidt (453)). Weiterhin be- obachteten Park und Zingher, daß die für die Toxinentgiftung nötige Formalinmenge von dem Gehalt des Toxins an Aminosäuren abhängig ist. Sdrodowski und Chalapina (466) haben sogar die Formoltitration von Amino- säuren nach Sörensen in den Toxinlösungen zur Bestimmung der zur Toxinentgiftung nötigen Formalinmengen herangezogen. Sie fanden, daß diese Mengen kleiner sind, als die zur Absättigung aller Aminogruppen im Toxin nötigen Formolmengen. Kissin und Bronstein (421) fanden, daß das Formoltoxoid weniger freier NH>- Gruppen als natives Ausgangstoxin (nach van Slyke bestimmt) enthält. Diese Ab- nahme verläuft den Veränderungen des Säurequotienten (s. oben) parallel. Der Quo- tient (NH2-N des Toxins) : (NH2-N des Anatoxins) ist zahlenmäßig beinahe derselbe wie der Säurequotient. Sie glauben, daß eine Hälfte der Aminogruppen des Toxins für seine Toxizität, die andere für seine antigene Wirksamkeit verantwortlich ist. Nach diesem Sachverhalt schien es, daß die Methylenisierung der Aminogruppen des Toxins durch Formaldehyd das Wesen des Entgiftungsprozesses darstellt. Die Sache wurde bedeutend komplizierter als Hewitt (417) die Befunde und selbst die Methodik von Kissin und Bronstein scharf kritisierte, besonders den Umstand rügte, daß dabei nicht mit dem gereinigten Toxin, sondern mit der Toxinbouillon, die mindestens 99,5 °/o unspezifischer Proteine enthält, gearbeitet wurde. Er selbst fand, daß nur 15 °/o des Amino-N des Toxins durch Formalin gebunden wird, auch wrenn so große Mengen von Formol zugegeben wurden, daß theoretisch der ganze Aminostickstoff gebunden werden könnte. Er vermutet, daß das Formalin irgendeine Veränderung dabei durch- macht. Es ist auch möglich, daß es sich mit mehreren Molekülen des Toxins (oder auch anderer Toxinbouillonbestandteile) vereinigt und zur Bildung von Polymerisaten des Toxins und Bouillonproteine führen kann. Leulier, Sedaülan und Clavel (428—430) beobachteten, daß das Formalin das ge- reinigte Toxin nur in Anwesenheit von Proteinen entgiften kann. Dieser Vorgang soll durch einen Zerfall der in älteren Bakterienkulturen angereicherten Nuklequotoiden begleitet werden. Diesen Körpern wird die Rolle des Schutzmittels der Toxizität gegenüber zugeschrieben. Auch Bunney (396) glaubte, daß das Formaldehyd erst sich mit den NH2-haltigen Substanzen der Bouillon (Glutaminsäure) vereinigt und daß erst dieser Komplex das Toxin entgiftet. Später zeigten Holden und Freeman (418), sowie S. Schmidt (453, S. 339), daß die Umsetzung des Toxins mit Formalin längere Zeit braucht, und daß die Reaktions- geschwindigkeit von der Formalinkonzentration genau so abhängig ist, wie im Falle der Methylenisierung der Aminosäuren. S. Schmidt fand weiter, daß die gereinigten Toxine ebenso leicht wie die Rohtoxine in Formoltoxoide übergehen, wenn nicht zu große Formalinkonzentration angewendet wird (sonst kommt es zum Verlust der antigenen Wirksamkeit des Toxins). Dasselbe konnte man an einem gereinigten mit Phosphatpuffer verdünnten Toxin nachweisen (Krestownikowa und Rjachina (423)). S. Schmidt (452) unterstreicht nochmals den grundlegenden Unterschied zwischen der Entstehung von „natürlichen“ Toxiden und der Formolentgiftung und weist darauf hin, daß, während es beim ersten Prozeß zu keiner Änderung des Aminostick- stoffgehalts des Toxins kommt, das Formoltoxoid weniger freie NH2-Gruppen als das native Toxin enthält. L. Velluz (469, 470) konnte dagegen keinen Unterschied bei der Methylenisierung einer gewöhnlichen und einer toxinhaltigen Bouillon finden. Das ist ganz leicht ver- ständlich angesichts des enormen Mißverhältnisses zwischen den Mengen des Toxin- proteins und denjenigen der übrigen Ballastproteine in Bouillon. Es wurde auch die Frage aufgeworfen, ob das Formalin nicht die Rolle eines Katalysators der „natürlichen“ Toxin-Toxoidumwandlung spielen könnte. Die bei der 59 Formolentgiftung auftretende Stabilisierung des Toxoids könnte dann als eine se- kundäre Reaktion beobachtet werden. Gegen diese Auffassung sprechen viele Be- obachtungen, z. B. über das Verhältnis zwischen der Formalinkonzentration und der Formoltoxoidbildungsgeschwindigkeit. Zusammenfassend hat sich S. Schmidt (452) über die bei ungereinigten Bouillon- toxinen gewonnenen Resultate folgendermaßen geäußert: man könnte annehmen, „daß das Toxin wirklich Aminogruppen enthält, und daß sich diese mit dem Formaldehyd verbinden. Daß die Entgiftung stattfinden kann, auch wenn nicht sämtliche Amino- gruppen des Milieus von Formol gebunden sind (Kissin und Bronstein oeobachteten bei der Formalinisierung den Verlust von ca. 50 °/o, Hewitt — von ca. 15 %, S. Schmidt — bis ca. 30 °/o des Gesamt-Aminostickstoffs der Toxinbouillon) könnte dadurch er- klärt werden, daß die Aminogruppen des Toxins eine viel größere Affinität zum For- malin aufweisen als die Aminogruppen der unspeziflschen Stoffe der Bouillon“. Wadsworth, Quigley und Sickles (478) konnten die Befunde von S. Schmidt be- stätigen. Sie haben das durch Ultrafiltration gereinigte Diphtherietoxin geprüft. Die Reaktion war t °- und pH-abhängig und in gewissem Maße reversibel. Sie besteht eigentlich aus zwei Reaktionen — einer schnell verlaufenden und reversiblen und einer langsamen und nicht umkehrbaren (Wadsworth, M. Pangborne (480)). Weiterhin schlossen Follensby und Hooker (402) aus ihren Versuchen, daß die For- molinaktivierung eine monomolekulare Reaktion sein muß; ihre Geschwindigkeit von der Formalin- und Hydroxylionenkonzentration, nicht aber von der Toxinkonzentrn- tion abhängig ist. Sie halten die Reaktion für eine durch Formol und OH-Ionen kata- lysierte Hydrolyse des Toxins. Alle diese bisherigen Arbeiten haben den Nachteil, daß sie mit ungenügend ge- reinigten Toxinpräparaten ausgeführt wurden. Erst mit der Schaffung der höchst- gereinigten Toxine ist die Möglichkeit für eine weitere erfolgsversprechende Bearbei- tung dieser sehr komplizierten und wichtigen Frage gegeben. Als erster Schritt in dieser Richtung ist die Arbeit von M. D. Eaton (399) zu be- zeichnen. An seinem höchstgereinigten Diphtherietoxin beobachtete er im Laufe der Formalinentgiftung folgende Veränderungen: 1. Im nativen Toxin liegt ca. V? des Gesamtstickstoffs als Amino-N vor. Bei der Formalinisierung wird ca. 1h dieser Amino-Gruppen irreversibel gebunden. 2. Die bei der Entgiftung auftretenden Veränderungen berühren diejenigen Toxin- stellen nicht, die für die Antitoxinbindung verantwortlich sind, weil bei der Formol- toxoidbildung das Verhältnis Lf pro mg N unverändert bleibt. 3. Es treten dabei auch keine Veränderungen an den assymetrischen C-Atomen auf, da die ursprüngliche optische Drehung des Toxins = —45 ° unverändert bleibt. 4. Es tritt eine Abnahme des Guanidin-N (bestimmt nach Sakagudie) auf. 5. Es werden wahrscheinlich die Endgruppen der Seitenketten, nicht die Peptid- bindungen des Toxinteilchens angegriffen. Nach L. Velluz (471) handelt es sich bei irreversibler Formolinaktivierung der Mikrobentoxine um eine Reaktion des H.CHO mit der NH2-Gruppe des Tryptophans, wobei anschließend noch eine Zyklisierung stattflnden kann, die zu einem Harman- Derivat führen kann. Dadurch wird aber gleichzeitig die serologische Spezifität des Toxins vernichtet. Diese Befunde und Überlegungen wurden durch die Beobachtungen von A. M. Pappenheimer u. a. ergänzt. H. Goldie (407, 408) hat mit Hilfe der Durchleitung des Ketens (CH2. CO) die Aminogruppen in der Toxinlösung azetiliert. Es tritt dabei eine schnelle Entgiftung auf (nach der Besetzung von 54 °/o der Aminogruppen mit Azetyl fällt die Toxizität auf weniger als Vaoo des Anfangswertes). Bei weiterer Azetilierung 60 wurde auch die antigene Wirksamkeit des Toxins erniedrigt, was bei gereinigtem Toxin schon bei der Besetzung von 45 °/o der Aminogruppen eintrat. Da das dialysierte, peptonfreie Toxin schneller als das nicht dialysierte durch Keten entgiftet wird, der Zusatz des azetylierten Peptons, aber, die Toxizität des Toxins nicht beeinflussen kann, glaubte Goldie, daß das Keten direkt auf das Toxinteilchen selbst, und nicht durch Vermittlung des anderen Nährbodenbestandteils ein wirkt. Pappenheimer (444) fand, daß es sich bei der kurzdauernden Keteneinwirkung bei pH = 6—7 in erster Linie um Azetylierung der endständigen Aminogruppen der Di- aminosäuren (tu - Aminogruppe des Lysins) handelt. Bei weiterem Ketenzusatz werden außer den Aminogruppen auch die Hydroxylgruppen des Tyrosins azetyliert. Das führt zum Verlust nicht nur der Toxizität, sondern auch der antigenen Wirksamkeit des Diphtherietoxins. Man sieht aus der obigen Darstellung wie die Umrisse des Strukturbildes des Toxinteilchens allmählich immer deutlicher werden. Es ist deshalb berechtigt, von dem weiteren Einsatz der physikalischen und chemischen Forschungsmethoden eine weitergehende Aufklärung dieses äußerst schwierigen Gebietes zu erhoffen. Eine andere theoretisch und praktisch sehr wichtige Toxinentgiftungs- und -zer- störungsart bildet seine Beeinflussung durch „physiologische“ chemisch definierte Substanzen, wie durch Ascorbinsäure, Adrenalin, Corticosteron und Glutathion. Be- sonders eingehend wurde die toxinentgiftende Fähigkeit der Ascorbinsäure unter- sucht. Über die diesbezüglichen Erfahrungen über die prophylaktische und thera- peutische Wirkung der Ascorbinsäure allein, sowie gemeinsam mit dem Neben- nieren-Rindenhormon beim Menschen und beim Tier wird ausführlich im Kapitel V berichtet. (Siehe auch O. Ehrismann (614)). Hier besprechen wir die Versuche über die Diphtherietoxin-Neutralisation durch diese Körper in vitro. E. Harde und M. Philippe (416) beobachteten, daß die Ascorbinsäure, mit dem Diphtherietoxin gemischt, dieses zu entgiften vermag. Sie beschädigt dabei die anti- gene Wirksamkeit des Toxins nicht. Ihre Wirkung ist wahrscheinlich zum Teil in- direkter Art; es wird vermutet, daß bei der Einverleibung des Ascorbinsäure + Toxin-Gemischs beim Tier durch Ascorbinsäure eine gesteigerte Sekretion des Adre- nalins hervorgerufen werden kann, die bei dem Toxinentgiftungsmechanismus in vivo eine wichtige Rolle spielen kann. C. W, Jungeblut und R. L. Zw.emer (419) könnten mit 0,5—5,0 mg des Na-ascorbinats bei pH = 6,6—6,8 in V2 Stunde bei Zimmertempe- ratur etwa 2 Dlm des Diphtherietoxins in vitro entgiften. Kleinere, sowie die größeren (bis 100 mg) Dosen des Na-ascorbinats erwiesen sich aber in dieser Beziehung als wirkungslos. Ebenfalls mit mittleren Na-ascorbinat-Dosen (10—20 mg pro 1—2 Dlm) erzielten C. K. Greenwald und E. Harde (412) die Toxinentgiftung in vitro. Gegenüber den höheren Toxindosen waren diese Na-ascorbinat-Mengen unzureichend. Die nicht neutralisierte Ascorbinsäure wirkt stärker als ihr Salz. 1 mgr Ascorbinsäure, ver- mischt mit SVs Dlm des Diphtherietoxins entgiftete in 18 Stunden bei Zimmertempe- ratur das Toxin soweit, daß 2 Dlm davon das Meerschweinchen nicht zu töten ver- mochten. Das pH des Gemisches betrug 4,0—4,4. Weiterhin konnten P. Polonyi (445), Schwarz und Cislaghy (465), Grotten und Bezsonoff (414), Hanzlik und Terade (415), J. Pakter und B. Schick (443), sowie J. Nitzesco, D. Timus und C. Angelesco (442) die toxinentgiftende Wirkung der As- corbinsäure in vitro bestätigen. Daß es sich dabei nicht um die Wirkung der Ascorbinsäure, als einer Säure, son- dern als eines Redoxkörpers handelt, haben B. Ghosh und B. C. Guha (403, 404) nach- gewiesen. Eine ähnliche Wirkung auf die Diphtherie (und Tetanus-) Toxine besitzen auch solche Redoxkörper, wie Zystein, Glutathion und Hydrochinon. S. Yokoyama (482) sah, daß 10 mg kristallinische Ascorbinsäure 2 Dlm, deren 50 mg —9—40 Dlm des Diphtherietoxins entgiften können. Die Ascorbinsäure wirkt 61 auf das Diphtherietoxin desto schwächer, je höher der pH-Wert der Lösung ist. Bei pH = 8>4 hört ihre Wirksamkeit völlig auf. Es handelt sich dabei nicht so sehr um die Neutralisation der Ascorbinsäure als Säure, als vielmehr um die Labilisierung ihrer wirksamen Red-Form, die bei höherem pH schneller irreversibel in die Diketogulon- säure übergeht. Es hat sich gezeigt, daß die einstündige Durchleitung von Sauerstoff durch 0,l°/«ige Lösung der Red-Form der Ascorbinsäure ihre toxinentgiftende Wirk- samkeit vernichtet. Dagegen wird das durch die Red-Form der Ascorbinsäure ent- giftete Diphtherietoxin bei der 02-Durchleitung nicht reaktiviert. Als eine weitere Stütze für die Auffassung über die Redox-Wirksamkeit der As- corbinsäure ist die Tatsache anzuführen, daß von verschiedenen Säuren bei pH = 3,4 nur die Oxal- und Essigsäure das Toxin deutlich abschwächen können; HCl wirkt schwächer, Äpfel- und Zitronensäure sind überhaupt ohne Wirkung. Von anderen Redoxsubstanzen entgiften das Glukoredukton das Diphtherietoxin stärker als die As- corbinsäure oder das Glutathion. A. Sigal und C. G. King (467) sahen ebenfalls, daß bei pH größer als 6 die Ascor- binsäure das Diphtherietoxin nicht entgiften kann. Bei pH = 3 geht die Inaktivierung schnell vor sich, so daß nach 24 Stunden praktisch das gesamte Toxin entgiftet ist. Daß man daraus aber nicht auf die alleinige Wirkung der Säurefunktion der Ascor- binsäure schließen kann, ist nach dem oben gesagten völlig klar. Um die Frage zu beantworten, ob die Wirksamkeit der Ascorbinsäure sich nur auf die toxische Funktion des Toxinteilchens erstreckt, untersuchten E. Schultz und U. Hecht (464) die Wirkung von mittleren Dosen des Na-ascorbinats bei pH = 6,6—6,8 auf die Fähigkeit des Toxins die Tiere spezifisch zu immunisieren. Es hat sich dabei herausgestellt, daß bei den Konzentrationen von 83,3 mg °/o das Na-ascorbinat die antigene Wirksamkeit des Diphtherie-Formoltoxoids abschwächt, während die klei- neren (8,3 und 16,6 mg °/o), sowie die stärkeren (ab von 192,3 mg9/o) Konzentrationen unwirksam sind. Das steht mit den Befunden von Jungeblut und Zwemer über die ausschließliche Wirksamkeit von mittleren Ascorbinsäuredosen auf die Toxizität des Diphtherietoxins im Einklang. J. Dieckhoff (397) bestätigte diese Befunde von Schultz und Hecht. Eine ähnliche entgiftende Wirkung wie die Ascorbinsäure übt auf das Diphtherie- toxin ein anderer „körpereigener“ Wirkstoff — das Glutathion in vitro aus. Diese Verhältnisse untersuchte P. Locatelli (432) besonders eingehend (s. auch H. Vincent (475)). Sie fand, daß, um die Entgiftung des Toxins herbeizuführen, das Glutathion eine gewisse Stehzeit gebraucht. In saurem Milieu ist die Entgiftung wirksamer als im neu- tralen oder alkalischen. Wenn das Diphtherietoxin in einer Lösung des reduzierten Glutathions den Meerschweinchen eingespritzt wird, überleben sie die Intoxikation und weisen keine automatischen Veränderungen in ihren Nebennieren auf. Wenn man das Diphtherietoxin mit Glutathion und Ascorbinsäure vermischt, 24 Stunden im Brutschrank aufbewahrt, dann verliert es völlig seine giftigen Eigen- schaften (Z, Kovacs (422)). Weiter ist der Befund von F. v. Gröer u. a. (413) noch aus dem Jahre 1914 von Interesse, daß das Adrenalin das Diphtherietoxin entgiften kann. In einer neueren Arbeit hat er mit seinen Mitarbeitern gezeigt, daß es die Diphenolkomponente des Adrenalins ist, die dabei auf das Toxin einwirkt. Ein Gramm von Brenzkatechin oder Hydrochinon (o- und p-Diphenol) können in vitro 30.000 Dlm des Diphtherietoxins entgiften. Die Entgiftung beginnt nach vier Stunden Stehen bei 37 ° und erreicht ihr Maximum nach 12—18 Stunden. Die Wirkung erfolgt auch ohne Sauerstoffzutritt. Das Toxin verliert dabei nicht nur seine Toxizität, sondern auch seine antigene Wirksam- keit. Interessant ist, daß das Resorzin (m-Diphenol) keine toxinzerstörende Wirkung ausübt, was auf die Bedeutung der sterischen Verhältnisse bei der Toxinzerstörung hinweist. 62 Auch D. C. Marie (434, 435) beobachtete, daß das Adrenalin und seine Salze das Diphtherie (auch das Tetanus-) toxin in vitro neutralisieren. Es wird vermutet, daß das Diphtherietoxin durch Adrenalin oxydiert wird, daß gleichzeitig auch die Bildung von Antikörpern gegen das Di-Toxin günstig beeinflußt wird. Die Befunde von R. L. Zwemer und C. W. Jungeblut, wonach die ungereinigten Nebennierenrindenpräparate, die etwa 1 gr der Nebennierenrinde entsprechen, 2 Dlm des Diphtherietoxins in V* Stunde bei Zimmertemperatur entgiften können, ist ver- mutlich auf eine Beimengung von Adrenalin und seiner Oxydationsprodukte zurück- zuführen. 4. Diphtherietoxin und Bakterienproteine Neben der Frage über die chemische Konstitution der Teilchen des Diphtherie- toxins und der für sie charakteristischen Reaktionen, stand schon seit dem Anfang der Diphtherieforschung das Problem der Genese des Toxins im Mittelpunkt mehrerer Untersuchungen. Die Fragen, die dabei zur Beantwortung standen, lauten: 1. Wo das Toxin entsteht — ob in der Bakterienzelle selbst oder erst im umgeben- den Nährsubstrat. Falls die Toxinbildung im Zellinneren stattflndet. 2. Auf welchem Wege das gebildete Toxin in die Flüssigkeit gelangt — durch einen Sekretionsakt oder durch die Auslaugung von abgestorbenen oder lebendigen Keimen. 3. Ob das Toxin in der Zelle schon als fertiges Produkt vorliegt oder wird es erst beim Übertritt in das Milieu aktiviert. 4. Sind die von dem Toxin befreiten Bakterienleiber noch imstande Reaktionen im WarmblütlerOrganismus hervorzurufen und wodurch diese bedingt sind. In den zwanziger Jahren dieses Jahrhunderts standen zwei Auffassungen über den Bildungsort des Diphtherietoxins entgegen. Die älteren Arbeiten von E. Roux und A. Jersin, H. Kossel (498) und Muriilo (504), sowie die neueren Untersuchungen von K. Fukutaki (492), M. Eisler und N. Kovacs (490), Eisler (489) und von J. Hirsch (497), sowie Fujioka (491) sprachen zugunsten der Ansicht, daß das Toxin in den Bakterien- zellen gebildet wird. Es Übertritt zum größten Teil durch Auslaugung der abgestor- benen Bakterienleiber in das umgebende Milieu. Für eine aktive Sekretion des Giftes wurden keine sicheren Grundlagen gefunden. Man kann das Toxin aus den ab- getöteten und gewaschenen Bakterienzellen durch Extraktion in wässerigen Lösungen erhalten. Die Bedingungen, unter denen diese Extraktion vor sich geht (pH, t°, Salz- gehalt, Alter der Kulturen, Wassergehalt der Bakterienzellen) wurden besonders ein- gehend von J. Hirsch (497) untersucht. Er fand, daß das destillierte Wasser aus trocke- nen Diphtheriebakterien erhebliche Mengen von N- und P-haltigen Bestandteilen extrahieren kann. Die Extrakte töten Meerschweinchen unter typischen Erscheinungen eines Diphtherietodes; die Toxizität ist unabhängig von dem N-Gehalt der Extrakte. Die Abgabe des Toxins an die Extraktfiüssigkeit erfolgt momentan, während der N erst allmählich hineindiffundiert. Die Menge des gelösten Stickstoffs ist der ange- wandten Substratmenge proportional, während das Toxin durch konzentrierte Extrak- tionsgemische besser ausgezogen wird. Beim Alkalisieren wird mehr Toxin als N extrahiert. Die Toxinextraktion ist wahrscheinlich mit einem Quellungsvorgang ver- bunden. Aus den älteren Kulturen wird mehr Toxin, aber weniger P extrahiert. Die Ex- trakte aus toxischen Stämmen sind N- und P-reicher als die aus atoxischen. Die Extraktionsgifte werden genau wie die gewöhnlichen Bouillongifte an der Ton- erde adsorbiert; die beiden Toxinarten scheinen identisch zu sein. 1923 veröffentlichten K. G. Dernby und L. E. Walbum (486) ihre Experimente, denen zufolge beim Zusatz von Pepton bzw. peptonhaltiger Bouillon zu den toxin- 63 haltigen Kulturfiltraten die Toxizität dieser Lösungen bedeutend zunehmen sollte. Daraus haben sie den Schluß gezogen, daß das Diphtherietoxin im Nährboden selbst aus den im vorhandenen Alburnosen und Peptonen unter dem Einfluß der von Diph- theriebakterien sezernierten Proteinasen entstehen muß. Diese Proteinasen sind in den zerriebenen und pulverisierten Diphtheriebakterien nachweisbar. Sie gehören zu den Endofermenten (die Diphtheriebakterien sezernieren keine extrazellulaer wirk- samen Proteinasen). Sie verflüssigen Gelatine, spalten Pepton, haben ihr pH-Optimum bei pH = 6.0—7.0 und gehören zu Tryptasen. Sie können vermutlich bei längerer Ein- wirkungsdauer das in der Kultur enthaltene Diphtherietoxin (Dernby und Siwe (487)). Der Eiweißgehalt solcher Kulturen nimmt ab, während der Amino-N zuerst an- steigt. Nach dem Überschreiten eines Maximums der Toxizität, tritt ihre Abnahme ein. Nach Vorstellungen von Dernby bilden die Diphtherie-Endotryptasen das Diph- therietoxin auf Kosten der Bouillon- und Bakterien-Albumosen und Peptone. Bei der weitergehenden Proteolyse verlieren diese Spaltprodukte an Toxizität (Dernby (488)). Außer durch eigene Endoproteinasen werden die Diphtherietoxine auch durch Trypsin, Erepsin, Hefetryptase, Pyocyanase, Prodigiosus- und Leukozytenfermente zerstört. Diese Theorie ist aber, wie sich später herausgestellt hat, als nicht zutreffend zu bezeichnen. Erstens haben H. Schmidt und W. Scholz (451) gezeigt, daß es sich bei der beobachteten Toxizitätszunahme nach dem Peptonzusatz um eine Rückwanderung und Reaktivierung des durch Alterung entstandenen Toxoids handelt, keineswegs aber um eine Neubildung des Toxins in bakterienfreiem Medium nur mit Hilfe der in die- sem Medium vorhandenen Diphtheriebakterien-Proteinasen. Das Diphtherietoxin ist einheitlich, tritt aber in verschiedenen Dispersitätsgraden auf. Zunächst bildet sich aus Alburnosen ein ungiftiges hochdisperses Toxon, das nachher unter Dispersitäts- abnahme in das giftige Toxin und schließlich in das ungiftige Toxoid übergeht. Die typische Diphtherie-Toxinwirkung ist an einen bestimmten Dispersitätsgrad gebunden. Durch Verdünnung der Toxoidlösung mit Bouillon oder durch Peptonzusatz wird das Toxoid wieder höher dispergiert und toxisch. In solcher Weise sei die Toxingiftigkeits- steigerung nach dem Bouillon- resp. Peptonzusatz zu erklären. R. Prigge (505) hat dann gefunden, daß die von Dernby und Walbum beobachtete Toxinneubildung beim Peptonzusatz zur bakterienfreien Toxinlösung statistisch unge- nügend gesichert ist, da die Toxizitätsbestimmungen an einer zu kleinen Anzahl von Tieren ausgeführt wurden. Bei einer Nachprüfung unter Einhaltung der zur statisti- schen Sicherung der Resultate führenden Kautelen konnte R. Prigge keinen toxizitäts- steigernden Einfluß des Peptons in der Toxinbouillon feststellen. Weiterhin hat er einwandfrei festgestellt (und damit die älteren Ergebnisse von Eisler und Kovacs, Fukutaki u. a. bestätigt), daß die Leibessubstanz abgetöteter, gewaschener, getrock- neter und pulverisierter Diphtheriebakterien im Tierexperiment dieselben Wirkungen wie die toxischen Kulturfiltrate hat. Dieses Zelltoxin ist in demselben Maße wie das Filtrattoxin thermolabil und durch Immunserum neutralisierbar. Dieses Zelltoxin konnte nicht durch Pressung in der Buchnerschen Presse, wohl aber durch Extraktion der abgetöteten Diphtheriebakterien mit Kochsalzlösung von den Zelleibern abgetrennt werden. Nach der Erschöpfung des in den Bakterien vor- handenen extrahierbaren Toxinvorrats durch mehrmalige Extraktion, sammelten sich in den Zellen nach mehrtägigem Stehen neue Toxinmengen an und konnten wiederum durch Extraktion mit Kochsalzlösung gewonnen werden. Wahrscheinlich ist diese An- sammlung neuer Toxinmengen in Bakterienleibern mit ihrem postmortalen Abbau- prozeß zu verbinden. Aus diesen Beobachtungen schloß Prigge: 1. daß die Theorie von Dernby und Walbum unhaltbar ist und 2. daß das Toxin ein Bestandteil der Bakterienzelle selbst sein und nach ihrem Absterben passiv von der umgebenden Flüssigkeit ausgelaugt werden 64 muß. Die Rolle des Peptons könnte etwa die eines Beschleunigers der Toxinextrak- tion, vermöge seiner Grenzflächenspannung erniedrigenden Wirkung oder die eines Stabilisators des aus den Zellen ausgetretenen Toxins sein. Man ist eigentlich noch den Nachweis schuldig geblieben, daß die Toxinbildung dem Bakterienwachstum parallel verläuft. Im Gegenteil, man beobachtete wiederholt, daß die Diphtheriebakterien sich üppig entwickeln, ohne nennenswerte Toxinmengen produzieren zu können. Dies ist zum Teil durch die Individualität der Stämme selbst, teilweise aber durch die Zusammensetzung des Nährbodens, bedingt. So bewirkt das Zystin eine deutliche Wachstums Verbesserung ohne die Toxinbildung zu begünstigen, während Arginin und Histidin gerade die Toxinproduktion steigern können. Auch die Wachstumsstadien der Kultur sind für die Toxinausbeute maßgebend. Anfänglich herrscht eine Übereinstimmung zwischen der Toxinanhäufung und dem Bakterien- trockengewicht, später aber fangen die autolytischen Vorgänge an, zu überwiegen, die zu einer Trockengewichtabnahme bei gleichbleibender Toxizität der Lösung führen. (Leulieu, Sedaillan, Clavel (429, 430)). Es taucht jetzt 6ine wichtige Frage auf. Man weiß noch nicht, ob das in vitro er- haltene Toxin mit dem in vivo wirksamen Körper oder Körperkomplexe, identisch ist. Eine ganz eigentümliche und in der bisherigen Literatur vereinzelt gebliebene Anschauung über die Natur des Diphtherietoxins und seine Beziehungen zu den Blut- serumproteinen hat W. N. Kryschanowski in seinen vier Veröffentlichungen darge- legt (499—501). Er ist von der Hypothese von L. E. Walbum (509) ausgegangen, wonach das Diphtherietoxin im tierischen Körper als eine Verbindung von dem durch Diph- theriebakterien gebildeten „Protoxin“ mit den Albuminen und sonstigen Proteinen des tierischen Organismus entstehen soll. Kryschanowski stellt sich das Diphtherie- toxin als eine Art von „prostethischer Gruppe“ vor, die in vitro wie auch in vivo von einer Bluteiweißfraktion zur anderen mehr oder weniger umkehrbar übergehen kann. Das „Protoxin“ soll eine besonders starke Affinität zum Fibrinoglobulin haben, so daß immer, wenn ein nicht denatuiertes oder durch andere Substanzen blockiertes Fibrinoglobulin vorliegt, das Protoxin sich vorwiegend mit dieser Frak- tion vereinigt. Beim Fehlen oder ungenügenden Mengen des disponierbaren Fibrino- globulins kann sich das Protoxin vorwiegend an Albumin und andere Serumproteine binden. Diese Bindung kann mehr oder weniger umkehrbar sein und beim Zusatz von flbrinoglobulinhaltigen Stoffen (frisches Blut oder Serum) mehr oder weniger leicht sich unter Abgabe des Protoxins an das Fibrinoglobulin auflösen. Die Reversibilität der Protoxin-Albumin-Verbindung soll bei ihrem Altern sich verlieren. Wenn das Protoxin sich mit dem Fibrinoglobulin vereinigt hat, wird es vom Autor als Virulenz- faktor bezeichnet und für die Virulenz der Diphtheriebakterien im Tierkörper in erster Linie verantwortlich gemacht. Wenn es aber eine Verbindung mit Albumin eingeht, wird es — der Toxizitätsfaktor genannt und von ihm soll die Toxizität der Keime abhängen. Außer diesen zwei Toxinarten, die nur toxisch, nicht aber antigen wirksam sind, schreibt Kryschanowski den Diphtheriestämmen noch die Fähigkeit zur Ausbildung von gleichzeitig toxischen und antigenen Protoxin-Euglobulin bzw. Pseudoglobulin- Verbindungen zu. Diese Verbindungen sollen besonders stark von sog. toxigenen Stämmen gebildet werden, dessen Protoxin mit dem Albumin zu, in der ersten Zeit lockeren, adsorptiven, schwach toxischen Komplexen sich verbindet. Infolge ihrer Reversibilität müssen diese an und für sich antigen nicht wirksamen Albuminkomplexe ihr Protoxin leicht an die Globuline abgeben. Diese antigenwirksamen Protoxin- Globulin-Komplexe sind desto aktiver, je weniger toxisch sie sind, und je stärker in ihnen die Globulin- über der Protoxinquote überwiegt. Darin sah Kryschanowski den grundsätzlichen Unterschied zwischen den sog. viru- lenten und toxigenen Diphtheriestämmen; bei den ersteren sind nur die Protoxin- Globulin-Verbindungen gleichzeitig toxisch und antigen wirksam; die Protoxin + 65 Fibrinoglobulin bzw. + Albumin-Verbindungen sind nur toxisch, nicht aber antigen wirksam. Bei den anderen — toxigenen — Stämmen vermögen die an sich auch nicht antigenwirksame Protoxin-Albuminkomplexe, infolge ihrer leichten Dissoziierbarkeit, das Protoxin an die antigen wirksame Globuline abzugeben. Bei ihnen sollen also auch die Albuminkomplexe indirekt antigen wirken. Auf Grund dieser Vorstellungen entwickelte der Verfasser in weiteren Arbeiten eine Hypothese über die Natur der einzelnen bei der Serotherapie wirksamen Kom- ponenten des Heilserums, sowie über die antiinfektiöse Wirkung dessen Euglobulins, das er als zweite Immungruppe des Immunserums bezeichnete (die erste soll das an Pseudoglobulin gebundene Antitoxin sein). Dieser ganze umfangreiche Fragenkomplex beruht in erster Linie auf der Hypo- these, nach welcher das von den Diphtheriebakterien ausgearbeitete Protoxin eine Art des leicht dissoziierbaren Anteils des Toxinteilchens darstellen muß, dessen „Apofer- ment“ die entsprechenden Blutserumproteine liefern sollen. Aus den obenzitierten neueren Arbeiten wissen wir, daß das Diphtherietoxin auch in einem völlig eiweißfreien synthetischen Nährboden entstehen kann; seine Bildung ist also nicht unbedingt an die Anwesenheit von fremden Proteinen gebunden. Daß das Diphtherietoxin selbst ein Protein ist, kann als sichergestellt betrachtet werden. Daß solche Eiweißsubstanz je nach den Milieubedingungen verschiedene Teilchen- größe besitzen kann, ist nach dem, was wir über die Labilität der Teilchengröße von verschiedenen Proteinen wissen, ohne weiteres möglich. Besonders in Anwesenheit von verschiedenen Serum- und Organproteinen im Tierkörper könnte es sehr leicht zu ihrer Vereinigung mit den Toxinteilchen kommen. Solche interkolloidale können so- wohl mit einer Vergrößerung sowie mit einer Verminderung des Dispersitätsgrade; des entstehenden Symplexes einhergehen. Dabei können auch die verschiedenen bio- logisch wichtigen Eigenschaften der miteinander reagierenden Partner weitgehende Veränderungen erleiden. Wegen der großen Wichtigkeit dieser Fragen wäre natürlich sehr wünschenswert, daß die entsprechenden Versuche mit den modernen höchstgereinigten Toxinpräpa- raten, unter Berücksichtigung unserer heutigen Kenntnisse über die Struktur der Teilchen der Serumproteine, wiederaufgenommen und fortgesetzt werden. D. V. Bori (485) überprüfte die 1938 von Pacchioni auf gestellte Hypothese, nach welcher das Diphtherietoxin als eine Art Ferments aufzufassen sei, das beim Zusatz zum Kaninchen- bzw. zum Meerschweinchenfieisch in vitro ein „sekundäres“ Diph- theriegift bildet. Bori fand, daß dieses „sekundäre“ Toxin 20 mal giftiger als die es er- zeugende Menge des Kulturfiltrat-Toxins ist. Semah (508) glaubte nachweisen zu können, daß die Extrakte aus dem Blut und Organen der an einer subkutanen Diph- therieinjektion verstorbenen Meerschweinchen in geringen Mengen neuen Meer- schweinchen eingespritzt, in einem beträchtlichen Prozentsatz zu typischen diphthero- toxischen lokalen Veränderungen und zum Toxintode der Tiere führen. R. A. R. O Meara (503) entwickelte die folgende Hypothese. Das Diphtherietoxin besteht aus zwei Substanzen; A und B. Die Substanz A ist in größeren Mengen im Reagenzröhrchentoxin enthalten und für Meerschweinchen stark toxisch. Die Sub- stanz B wird in vitro sehr wenig gebildet, während sie bei hypertoxischen Diphtherie- erkrankungen des Menschen in äußerst großen Mengen entsteht. Die Substanz B soll, wenn im Überschuß vorhanden, die Durchdringung der Gewebe mit der Substanz A fördern. Es kommt, durch ihre Wirkung zur Entwicklung stärkerer lokaler Erschei- nungen, zu größeren Oedemen und Nekrosen, sowie zu häufigeren Lähmungen. In dieser die Toxindiffusion begünstigenden Wirkung der Substanz B könnte man eine gewisse Ähnlichkeit mit dem Duran-Reynalschen Diffusionsfaktor — Hyluronidasc sehen (H. Schmidt (507)). 66 Alle diese Anschauungen und Befunde wurden bisher noch nicht von anderen Autoren einer kritischen Überprüfung unterworfen. Von ebenso großem Interesse ist die Frage über die pathogenetische Bedeutung der toxinfreien Proteine, der Bakterienkörper, also die Frage der Diphtherie-Endo- toxine (Dessy (511)). R. Prigge hat gezeigt, daß die vom Toxin befreiten Bakterienkörper der Diphtherie- bakterien für Meerschweinchen völlig atoxisch sind. H. Goldie (493) fand, daß die mit Immunserum gewaschenen Bakterienzellen selbst kein Toxin haben, bei ihrer Autolyse aber ein Körper entsteht, der beim Meer- schweinchen Abszesse macht und durch spezifisches Serum nicht neutralisiert wird. Als Folge der Einverleibung dieser Substanz geht das Tier an einer Kachexie ein. Die gegen Diphtherie immunisierten Tiere besitzen diesem Körper gegenüber eine größere Abwehrkraft als die ungeimpften; sie unterliegen der Intoxikation nicht, geben eine stärkere lokale Reaktion und entwickeln bei intraperitonealer Endotoxinverleibung ein polynukleäres Exsudat. Bei Mäusen ruft diese endozelluläre Substanz (494—496) an der Stelle der Injektion eine große Nekrose sowie das allgemeine Vergiftungsbild hervor (mit Durchfällen und Lähmungen). Die endozelluläre Substanz ist thermostabil, bei stärkerer Erhitzung er- leidet sie, aber, einen Toxizitätsverlust (3). Sie ist auch gegen Säure und Alkohol resi- stent; lipoidlösende Mittel schwächen ihre Wirksamkeit ab. Es wird daraus gefolgt, daß es sich hierbei um Lipoproteinkomplexe handeln kann. 67 V. Pathologische Physiologie der Wirkung des Diphtherietoxins unter Berücksichtigung der einzelnen Gewebe und Organe und der dadurch bedingten Stoffwechselstörungen Das Wachstum der Diphtheriebakterien im infizierten Organismus führt zu zweier- lei Störungsgruppen. Es kommt einerseits am Orte der Ansiedlung der Keime zur Ausbildung von lokalen Veränderungen, die meistens die Form einer fibrinösen Ent- zündung annehmen. Andererseits beobachtet man bei der Menschendiphtherie eine Reihe von krankhaften Erscheinungen, die auf die allgemeine Toxinvergiftung des Organismus zurückzuführen sind. Bei der Entstehung von lokalen Schädigungen auf den Schleimhäuten und Wund- llächen spielen folgende Momente eine wichtige Rolle: a) das Haften der angesiedelten Keime an der Oberfläche der befallenen Schleimhäute oder Wundflächen; b) die schä- digende Wirkung des von Bakterien gebildeten Toxins (möglicherweise auch anderer spezifischer oder unspezifischer Wirktstoffe der Keime) auf das unterliegende Gewebe; c) Diffusion von diesen Wirkstoffen durch das Gewebe; d) Einwirkung der herein- diffundierten Wirkstoffe auf die Wände der in diesem Gewebe verlaufenden Blut- gefäße, die zu ihrem Undichtwerden und zum Austritt von verschiedenen Blutbestand- teilen ins Gewebe bzw. auf seine Oberfläche führt. Über den näheren Mechanismus dieser Teilvorgänge, sowie über die dabei tätigen Wirkstoffe der Diphtheriebakterien und des infizierten Organismus selbst kann man sich zur Zeit kein einheitliches Bild machen. H. A. Gins, G. Kroemer und Th. Link (514) haben in histologischen Präparaten die nach einer subcutanen Infektion mit 24-stündigen Diphtheriekulturen bzw. nach einer intrakutanen Injektion von Diphtherietoxin beim Meerschweinchen in der Haut auf- tretenden morphologischen Veränderungen verfolgt. Während ein Teil der Tiere vor dem Versuchsbeginn durch mehrmalige Injektion von untertödlichen Mengen von lebenden Diphtherie-Bazillenkulturen bzw. von Diphtherietoxin aktiv immunisiert wurde, blieben die anderen nicht vorbehandelt und haben als Kontrolle gedient. Die betreffenden Hautstücke wurden durch Exzision V2, 1, 3 und 24 Stunden nach der Infektion bzw. Intoxikation entnommen und histologisch untersucht. Bei den nicht vorbehandelten, mit Diphtheriebakterien infizierten Tieren erlitten die, nach einer halben Stunde noch ganz locker im Gewebe zerstreuten, Bakterien in Verlaufe wei- terer Stunden eine Agglomeration zu Haufen. Schon nach einer halben Stunde kam es zur Leukozytenansammlung in einem Teil der Blutgefäße der infizierten Haut und zur Ausbildung von kleineren perivasculaeren Infiltraten. Auch die Bakterienphago- zytose, vorwiegend durch Neutrophile, war schon zu dieser Zeit lebhaft im Gange. In späteren Stunden nimmt die Leukozyteninflltration des bakterienhaltigen Gewebes und die Phagozytose stark zu, die freiliegenden Bakterienhäufchen kommen kaum mehr vor. Nach 24 Stunden ist das Gewebe stark mit Leukozyten infiltriert, die Bakterien sind nur in Leukozyten als Körner und Bakterientrümmer zu erkennen. Die Leuko- zyten und deren Reste bilden neben dichten, ausgedehnten Infiltraten noch eine Reihe von lockeren Anhäufungen, aus Polynuklearen und einkernigen Makrophagen be- stehend. Die Reaktionen der vorbehandelten Tiere zeichnen sich durch die größere Intensität und den früheren Anfang der Leukozytenemigration und der Phagozytose, sowie durch eine schnellere Agglomeration von Bakterien aus. Nach 24 Stunden ist der Um- fang der Infiltrate erheblich geringer als bei den nichtvorbehandelten Meerschweinchen und der ganze Prozeß scheint im Rückgang zu sein. 68 Bei den mit Di-Toxin vergifteten nicht vorbehandelten Tieren kam es ebenfalls in den ersten Stunden zu einer Infiltration des Schädigungsstandes mit Leukozyten, diesmal vorwiegend mit einer oxyphylen Körnelung. Später überwiegen auch hier die Neutrophylen. Die ausgewanderten Leukozyten verfallen schnell einer Degenera- tion, die in ihren anfänglichen Stadien durch Karyopyknose ausgezeichnet ist. Bei den immunisierten Meerschweinchen tritt auch in diesem Falle die Leuko- zytenauswanderüng schneller und stärker ein. Auch hier verläuft die Abwehr schneller als bei den nicht vorbehandelten Tieren; die Leukozytendegeneration ist kaum bemerk- bar. Es fällt dabei nach 24 Stunden eine reichliche Durchtränkung des Gewebes mit einem fibrinösen Exsudat, sowie das Auftreten von zerstreut liegenden, 6-10 Mikronen großen kristallinischen Körpern und kleiner runder dunkelfarbiger Körnchen auf, die von den Verfassern auf die Toxin-Antitoxin-Reaktion im Gewebe zurückgeführt werden. Auch J. Hammerschmidt (515) konnte im Tierversuch zeigen, daß sowohl bei den aktiv wie bei den passiv immunisierten Meerschweinchen die Diphtherieabwehr auf einem rein leukozytären Mechanismus beruht; außerdem scheint die Zusammensetzung der Gewebsflüssigkeiten auf das Wachstum der einverleibten Diphtheriebakterien eine gewisse Wirkung auszuüben. So entwickeln sich die Diphtheriebakterien, die den diph- therieunempfindlichen Ratten in die subkutan eingebrachten Agarblöcke eingespritzt wurden, nur in den körperfernen zentralen Agarpartien zu größeren und zahlreicheren Kolonien, während sie an der Agarperipherie seltener und kleiner sind. Bei den diph- therieempfindlichen Meerschweinchen liegen die Verhältnisse umgekehrt: es scheint als ob die Gewebssäfte von Meerschweinchen die Entwicklung von Diphtherie-Agar- kulturen in vivo fördern, die der Ratten-Gewebssäfte sie dagegen zu hemmen im- stande sind. Bei den nichtvorbehandelten Tieren wird die Phagozytose der Diphtheriebakterien außerdem durch Toxineinwirkung paralysiert und es kommt dabei zu einem größeren Leukozytensterben im Gewebe. Das Diphtherie-Heilserum zeigt dabei keine bakterizide oder opsonische Wirksam- keit auf. Es sei in diesem Zusammenhänge auch auf das von H. Dold (512, 513) und seine Schule aufgerollte und von mehreren Forschern mit verschiedenem Erfolge bearbeitete Problem der Beeinflussung der Vitalität, Virulenz und Morphologie der Diphtherie- bakterien durch Speichel, Nasenschleim, Milch und andere Körperflüssigkeiten und deren zellfreie Filtrate, hingewiesen. Andererseits eröffnete die Entdeckung und Er- forschung des sog. Daran-Reynalschen Diffusionsfaktors (507) neue Wege beim Stu- dium der Ausbreitung von verschiedenen gelösten, sowie korpuskulären Elementen im Unterhautzellgewebe, sowie überhaupt in den mit Bindegewebe ausgefüllten Lücken zwischen einzelnen parenchymatösen Organen. Es handelt sich dabei um sog. Hyaluronidasen, d. h. eine Fermentgruppe, die die verschiedenen Körpermuzine und -mukoide (N-haltige Polysaccharide) zu hydrolisieren vermögen. Die Übertragung dieser neueren biochemischen Erkenntnisse auf die Pathogenese der Tier- bzw. Men- schendiphtherie bleibt zur Zeit noch aus. Über den Werdegang der toxischen Nekrotisierung der Deckepithelzellen, sowie über die Wirkungsweise des Toxins auf die Gefäßwände wissen wir von der patho- physiologischen Seite praktisch gar nichts. Im Allgemeinen ist die Pathogenese der lokalen Schädigungen bei Diphtherie noch sehr wenig erforscht. Man kann nur hoffen unter Anwendung unserer modernen Errungenschaften auf den Gebieten der Toxin-, Ferment- und anderer Wirkstofforschung mit der Zeit in diese Frage viel tiefer ein- dringen zu können. Bedeutend mehr wissen wir über die Pathogenese der bei der Diphtherieintoxika- tion vorkommenden allgemeinen Störungen des Stoffwechsels, sowie über die in ver- schiedenen inneren Organen sich dabei abspielenden pathologischen Vorgänge. 69 1. Toxinverteilung im Körper Es wurde schon früher betont, daß gerade in der letzten Zeit einige Arbeiten er- schienen sind, die auf eine mögliche Nichtidentität des in vitro in Diphtheriekulturen sich bildenden Toxins mit dem in vivo wirksamen Produkten der Diphtheriebakterien- tätigkeit im infizierten Organismus hinweisen. Da wir aber zur Zeit nichts Näheres über die Natur dieser „sekundären“ Gifte wissen, noch überhaupt diese Beobachtungen von anderen Autoren nachgeprüft und bestätigt worden sind, bleiben wir bei der An- nahme, daß das in vitro entstehende Toxin praktisch der einzige im erkrankten Or- ganismus tätige Wirkstoff der Diphtheriebakterien ist. a) Toxin im Blut. Der Nachweis des freien Toxins im kreisenden Blut scheiterte längere Zeit an der ungenügenden Empfindlichkeit der früher angewandten Toxin- nachweismethoden, die die äußerst geringen Mengen von Toxin im Blut nicht er- fassen konnten. Deshalb sind die älteren Angaben von A. Uffenheimer (549) und E. Neumann (537) über den ihnen im Blut der Diphtheriekranken gelungenen Toxin- nachweis mit größter Vorsicht zu beurteilen. Sie bedienten sich der subkutanen bzw. intrakutanen Dosierungsmethoden, deren untere Empfindlichkeitsgrenze für die in Betracht kommenden kleinen Toxinmengen (0,1—0,01 Dlm) pro 1 ccm Serums zu hoch liegt. Erst die Erfindung der intrakornealen Toxindosierung am Kaninchen durch E. Gildemeister und Watanabe (529) erlaubte ihnen, das Vorhandensein von Diph- therietoxinspuren im Serum der infizierten Meerschweinchen nachzuweisen. Das Serum verursachte auf der Cornea eine spezifische diphtherotoxische Geschwürsbil- dung nur, wenn es nicht mehr als dreifach mit NaCl verdünnt wurde. Dies bedeutet nach Gildemeister, daß in der gesamten Körperflüssigkeit beim Meerschweinchen 24 bis 48 Stunden nach einer an sich tödlichen Diphtherieinfektion mindestens lU Dlm freien Toxins vorhanden sein muß. Bei einem von 36 Diphtheriekranken wurde mit Hilfe dieser Kornealmethode das Vorhandensein des freien Diphtherietoxins im Blute nachgewiesen (E. Gildemeister (528)). 1938 konnte H. Steinmaurer (547) mit Hilfe einer abgeänderten Jensenschen Nach- weismethodik im Serum einiger an toxischer Diphtherie erkrankter Kinder das freie Toxin nachweisen. Der Toxingehalt schwankte von 0,04—0,1 Dlm pro 1 ccm. Ein Kind mit 0,2 Dlm pro 1 ccm Serum starb, ein anderes mit nur 0,075 Dlm genas. Die kritische noch verträgliche Toxinkonzentration soll demgemäß bei 0,1 Dlm pro 1 ccm liegen. b) Verteilung, Bindung und Ausscheidung des Toxins. Noch Pettit (539) beobachtete an für das Diphtherietoxin weniger empfindlichen Ratten, daß ein Teil des einge- spritzten Toxins im Urin auftritt. R. Bieling und A. Gottschalk (518) verfolgten mit Hilfe der intrakutanen Dosie- rungsmethode (Meerschweinchen) nach Römer die Verteilung des intrakardial dem Meerschweinchen eingespritzten Diphtherietoxins in verschiedenen Organen. Das Tier wurde nach dem Töten entblutet; trotzdem muß man mit gewissen Mengen des zu- rückgebliebenen toxinhaltigen Blutes, besonders in den blutreichen Organen (Leber, Milz) rechnen. Schon 20 Minuten nach der Injektion von 0,25 ccm Diphtherietoxin verschwindet sein größter Teil aus dem Blut. Trotzdem befindet sich zu dieser Zeit im Blut noch bedeutend mehr Gift als in den inneren Organen. Das Gehirn ist fast toxinfrei. Die wässerigen Extrakte aus diesem Organ ergeben Hautreaktionen, die denen 1 : 10.000 verdünntem Toxin entsprechen. Leber- und Nebennierenextrakte erzeugten Hautreak- tionen entsprechend einer 1 :4.000 Toxinverdünnung, die Extrakte aus Milz- und Nieren-Reaktionen wie 1 ; 1.000 verdünntes Toxin. Das Serum erzeugte eine der 1 : 100 Toxinverdünnung äquivalente Reaktion. 70 Nach 4V2 Stunden ist die durch Serum erzeugte Reaktion ca. 40 mal schwächer und entspricht einer Toxinverdünnung von 1 : 4.000. Von den Organen verlieren Milz und Nebennieren relativ mehr an Toxin als Leber und Niere. Die Nieren enthalten noch relativ viel Toxin, was wahrscheinlich mit seiner jetzt auftretenden Ausscheidung im Harn im Zusammenhang stehen muß. Zu diesem Zeitpunkt enthalten Herz- und Skelettmuskel etwas weniger freies Gift als die Leber, die Haut noch weniger als die Muskulatur. Das Gehirn ist wiederum völlig giftfrei. Dieses in der Kochsalzlösung bei der Extraktion auftretende Toxin müßte in den betreffenden Organen nur locker, wahrscheinlich adsorptiv gebunden sein. Außerdem binden die verschiedenen Gewebe noch gewisse Toxinmengen viel fester, irreversibel. In einer späteren Versuchsreihe stellten Bieling und Gottschalk (519) eine Bilanz der Toxinbewegung in vergifteten Tierkörpern auf. Nach ihrer Berechnung sind fünf Stunden nach der Injektion von 1 ccm Toxin — im Serum maximal noch 0,16 ccm enthalten, in der gesamten bis zu jener Zeit ausgeschiedenen Harnmenge (3,6 ccm) — maximal 0,144 ccm, in Kot und Galle — praktisch nichts, in Organen — maximal 0,285 ccm. Die nicht wiedergefundene Menge von ca. 0,4 ccm Toxin (40% der einge- spritzten Dose) ist als im Tiergewebe irreversibel gebunden oder zerstört zu betrach- fen. Natürlich sind solche Berechnungen sehr weit von Genauigkeit entfernt. Es sind aber hierbei überall die höchstmöglichen Werte für den Toxingehalt verschiedener Organe und Exkrete angesetzt. Von den möglichen Fehlerquellen, die bei dieser Bilanzaufstellung berücksichtigt werden müssen, scheidet die eventuelle Zerstörung des Toxins im Harn beim Stehen deshalb aus, weil die Stehzeit zu kurz ist, um das nachgewiesenermaßen weniger empfindliche starke Toxin im Urin merklich abzu- schwächen. Die Bestimmung der etwa in den Blutzellen gebundenen Toxinanteile ist mit intrakutaner Methode wegen der zu starken unspezifischen Reaktionen unmöglich; diese Mengen sollten aber nach Bieling und Gottschalk das erhaltene Ergebnis nicht sehr stark abändern. Nach L. J, Stefanenko (546) adsorbieren die Menschen-, Kanin- chen- und Hundeerythrozyten nur sehr wenig Toxin. Das Toxin, das in der ersten Zeit nach der Einspritzung in den Organen aufge- stapelt ist, verschwindet schon in fünf Stunden zum größeren Teil. Gleichzeitig setzt auch die Toxinauscheidung im Urin ein; sie ist aber nicht groß genug, um für die ge- samte aus den Organen verschwundene Toxinmenge eine Erklärung zu geben. Es muß sich also um eine Zerstörung des Toxins in den Organen selbst handeln. Die bei diesen Versuchen besonders stark ausgeprägte Toxinarmut des Gehirns er- klären die Autoren mit einer Undurchlässigkeit der Blut-Liquor-Schranke für das Diphtherietoxin. F. Vacirca (550) injizierte den Ratten subcutan das Diphtherietoxin. Noch nach 24 Stunden konnte er es auf der Injektionsstelle nachweisen. Ein Teil des Toxins er- schien zu dieser Zeit im Harn; zum Teil wurde es im kreisenden Blut gefunden. Nach 24 Stunden war in Milz, Leber, Nieren und Nebennieren keine nachweisbare Toxin- menge vorhanden. Die Extirpation der Schilddrüse wirkte auf die Toxinausscheidung im Harn vermindernd. U. Friedemann und A. Elkeles (527) beobachteten beim Kaninchen, daß, 2V2 Dlm Toxin, intravenös eingespritzt, aus dem Blut im Laufe von zehn Minuten vollkommen verschwinden. Der Einwand, daß bei allen Toxinbestimmungen in verschiedenen Organen und Geweben das eventuell noch nicht völlig entfernte Blut die erhaltenen Resultate stören kann, verleiht den Versuchen über die Toxinbindung im Blut eine besonders große Bedeutung. Coca, Rüssel und Baughman (522) untersuchten den Toxingehalt im Ge- samtblut bei intraperitoneal mit Diphtherietoxin vergifteten Meerschweinchen und Ratten und fanden, daß das Meerschweinchenblut 3,5—5mal weniger aktives Toxin enthielt als das Rattenblut. Das wurde durch kleinere Toxinbindungskraft des Blutes der weniger empfindlichen Ratten erklärt. M. Glusmann (530), sowie B. Sbarsky (542, 71 543) glauben auf Grund ihrer Untersuchungen schließen zu dürfen, daß die Empfind- lichkeit gegenüber dem Diphtherietoxin einzelner Tierarten mit der Fähigkeit ihrer Erythrozyten, das Toxin zu adsorbieren, im Zusammenhang stehen muß. Es gibt aber dabei keinen Unterschied zwischen den Erythrozyten von unbehandelten und von den aktiv immunisierten Meerschweinchen. Dies wurde auch von Dujarric de la Riviere und Kossovitch (524) bestätigt, die außerdem fanden, daß die Erythrozytenstromata das Toxin im Gegensatz zu intakten Erythrozyten praktisch nicht binden. Erst N. Grlasnow (532), dann aber besonders H. Schmidt (544, 545), haben diese Frage endgültig im negativen Sinne entschieden und damit die Vermutung von Bieling und Gottschalk über die Nichtbindung des Toxins an Erythrozyten bestätigt. Die vom Serum möglichst befreiten Erythrozyten binden kein Diphtherietoxin; die bei den ungenügend gewaschenen Erythrozyten beobachtete Toxinbindung ist auf die ihnen beigemengten Serumreste zurückzuführen. Im Serum ist aber nur die Globulin- fraktion, nicht aber die der Serumalbumine bindungsfähig. Dies gilt auch für die praktisch antitoxinfreien Seren, so daß es sich hier nicht um eine spezifische Toxin- Antitoxinbindung handeln kann. Die Menschenleukozyten binden nach sechsstündigem Stehen etwas von Diphtherie- toxin, wobei es gleichzeitig zu ihrer Auflösung kommt (P. Ritossa u. L. Hirsch (541)). Die Pferdeleukozyten aus dem Zitratblut entgiften in vier Stunden bei 37 ° das Diphtherietoxin und sterben dabei zu ca. 15 % ab (geschätzt nach ihrer Vitalfärbbar- keit mit Methylenblau). Die durch Hitze abgetöteten Leukozyten sind unwirksam (Vernichtung von Leukozytenfermenten). Auf das Tetanustoxin wirken die nativen Leukozyten ebenfalls entgiftend ein (Kobzarenko (531)). Dagegen konnten Wadsworth und Vöries (398) keine nennenswerte neutralisierende Fähigkeit der Hunds- und Meerschweinchenleukozyten den Diphtherie- und Tetanustoxinen gegenüber fest- stellen. Ebenfalls erwiesen sich die Lymphozyten aus Mesenterialdrüsen von Kanin- chen den Toxinen gegenüber als unwirksam (Moor und Newport (535)). Was die Phagozytose der Diphtheriebakterien durch Leukozyten anbetrifft, so fand Bachmann (516), daß die Diphtheriebakterien schlechter als Pseudodiphtheriebakterien phagozytiert werden; diese Regel ist aber keine allgemeingültige. Das Blutserum der diphtherieinfizierten Meerschweinchen besitzt eine Fähigkeit, die die Phagozytose der Diphtheriebakterien durch Leukozyten aus normalem Blut zu läh- men (Cantor (520)). Diese Wirkung wird dem im Blut vorhandenen Diphtherietoxin, evtl, den noch unbekannten aggressinartigen Stoffen darin zugeschrieben. Nach der Ansicht von Gogin (533) ist es nicht das Diphtherietoxin, das die Phago- zytose hemmt, sondern die unspezifischen Toxinbouillon-Bestandteile. Das sei daraus ersichtlich, daß auch die erhitzte Toxinbouillon die Phagozytose hemmen kann und daß diese Wirkung nicht durch das Antitoxin beeinflußt werden kann. Im Serum von nicht mit Diphtherieserum behandelten Diphtheriekranken wurde eine leukolytische Fähigkeit festgestellt, die von dem im Blute kreisenden Diphtherie- toxin verursacht und durch das Diphtherie-Antitoxin hemmbar ist (Lubrano und Pavani (536)). Interessant ist auch die Beobachtung von Wadsworth und Hoppe (510), wonach die Bouillonkulturfiltrate von Diphtheriebakterien (und 12 anderer Keime) die Phago- zytose von Staphylokokken durch Hundsleukozyten hemmen können. Die Wirkung ist aber von dem Toxingehalt solcher Filtrate unabhängig und durch das Diphtherieanti- toxin unbeeinflußbar. Die Wirkung der Filtrate ist durch das Waschen der Leukozyten mit Kochsalzlösung rückgängig zu machen. Sie ist t°- und lichtunempflndlich, wird aber durch Pepsin und Trypsin abgeschwächt. In älteren Kulturen ist sie stärker als in jüngeren, kommt auch in den Berkefeld-Kulturflltraten vor und ist von der Bouillon- zusammensetzung unabhängig. , Die Endothelzellen der Blutgefäße, sowie überhaupt die RES-Zellen binden prak- tisch kein Diphtherietoxin, wie es aus den Versuchen von H. Schmidt mit der Cu- Blockade des RES-Systems bei den intravenös vergifteten Meerschweinchen her- vorgeht. Mit den in vitro angestellten Versuchen konnten H. Schmidt und P. Stockhusen (545) das Toxinbindungsvermögen verschiedenartiger Gewebesuspensionen von Meer- schweinchen verfolgen. Dabei erwiesen sich das Hirngewebe und die Leber an erster Stelle als besonders stark toxinbindend. Nieren, Nebennieren, Lunge, Myokard, Skelettmuskeln, Milz, Lymphdrüsen haben viel weniger Toxin gebunden. Ritossa (540) hat die Diphtherietoxin-Bindung durch das verschiedene Gewebe in vitro studiert und dabei die folgende Reihenfolge ihrer Bindungsfähigkeit auf gestellt: Leber, Nieren, Nebennieren, Herz, Lunge, Milz und Gehirn. H. Kleinschmidt fand noch 1912, daß die frischen Gehirnzellen von Meerschweinchen in vitro das Toxin binden können. Auf den darin enthaltenen Gegensatz zu der von Bieling und Gottschalk beobachteten Toxinarmut des Gehirns der diphtherievergifteten Tiere, sowie auf die allgemeine Be- deutung dieser Fragen für das Verständnis der Gehirnschädigung bei Diphtherie, kommen wir in dem Kapitel über das Gehirn noch zurück. Jetzt wollen wir aber den aus der Affinität des Diphtherietoxins zu dem Gehirn- gewebe gezogenen Schluß über die Anreicherung des Toxins in den lipoidhaltigen Ge- weben etwas eingehender behandeln. W. Noster (538) spritzte den Meerschweinchen ein Gemisch aus 3°/oiger Lösung von Cholesterin in Olivenöl und Diphtherietoxin ein und sah, daß besonders, wenn das Gemisch 3—6 Stunden vor der Einspritzung im Brut- schrank gestanden hat, einige Tiere die Vergiftung überstehen können. Auch nach einer prophylaktischen Vorbehandlung der Tiere mit Cholesterin sah er, daß von 18 vergifteten Tieren — 16 die Einspritzung überlebten. Diese toxinentgiftende Wirkung des Cholesterins (und Lanolins) haben auch Eisler und Gottdenker (525, 526), Leupold und Bogendörfer (534), Beniner (517), Suranyi und Jarno (548) u. a. gesehen, die an toxinumhüllende und dadurch seine Resorption verzögernde Wirkung der Lipoide denken. Außerdem soll nach Noster die nach der Lipoiddarreichung auftretende Li- poidanreicherung in inneren Organen eine schützende Rolle spielen. Im Gegensatz dazu fand Filia (zit. nach Clauberg und Hückel (521)) keine Wirkung des Cholesterins bei den diphtherievergifteten Tieren. Das Lezithin beschleunigt ihren Tod. H. Jürgens erzielte mit Cholesterin- bzw. Lezithinfütterung das Auftreten von einer Fettinflltration des Myokards und eine Verkürzung der Überlebensdauer nach Diphtherieintoxikation bei Meerschweinchen. Degkwitz (523) zog daraus den Schluß, daß die Lipoid Vermehrung in Organen den Organismus zu dem malignen Diphtherie- verlauf geradezu disponiert. Angesichts dieser Kontroverse über die Bedeutung der Lipoide bei der Diphtherie- erkrankung haben K. W. Clauberg und K. Hückel (521) die Meerschweinchen mit Cholesterin bzw. Lezithin gefüttert und dadurch den Lipoidgehalt ihrer Organe ge- steigert. Trotzdem sahen sie keinen Unterschied hinsichtlich der Überlebensdauer und pathologischer Veränderungen nach einer Diphtherieintoxikation zwischen den mil Lipoiden gefütterten und Kontrolltieren. Ob es tatsächlich Lipoide sind, die in den Geweben die Toxinbindung gewährleisten, ist zur Zeit nach diesen Autoren noch nicht zu entscheiden. Die Versuche in vitro müssen nicht unbedingt den Verhältnissen in vivo entsprechen. Jedenfalls muß als feststehend angesehen werden, daß gewisse Gewebe das Diphtherietoxin aus dem Blut an sich reißen und erst locker, mit der Zeit aber immer fester binden können. Ob das Toxin dabei nur an der Oberfläche der Zellen bleibt oder auch in das Zell- innere eindringt ist bis jetzt noch nicht eindeutig festgestellt. Seine schädigende Wir- kung könnte das Toxin auch von der Zelloberfläche ausüben. Mit welchen Zellbestandteilen es dabei zuerst zur Reaktion kommt, welcher Art die dadurch im betreffenden Zellsubstrat und an dem Toxin selbst auftretenden Verände- rungen sind; alle diese höchst wichtigen Fragen sind bisher auch ungelöst geblieben. 73 2. Wirkung auf die Gewebskulturen in vitro Nach den ersten diesbezüglichen Arbeiten von Levaditi und Muttermilch (554, 555, 556), sowie von Suzuki (zit. nach Krontowski (552)) wirkt das Diphtherietoxin hem- mend auf das Wachstum der Kulturen von Fibroblasten in vitro. Die Auswanderung von Monozyten und Polynuklearen aus dem Explantat bleibt dabei unberührt, die Herzmuskelzellen behalten ihre Kontraktilität bei. Die Wirkung des Diphtherietoxins auf Fibroblasten ist durch das spezifische Antitoxin neutralisierbar. Nach Mendeleef (557) werden die Milz- sowie Bauchfellexplantate von normalem Meerschweinchen, in normalem Plasma gezüchtet, durch das Diphtherietoxin getötet; im antitoxinhaltigen Plasma entwickeln sich die toxinvergifteten Explantate weiter. Die Milz von den aktiv oder passiv immunisierten Meerschweinchen, gezüchtet in einem normalen Plasma, wird aber vom Diphtherietoxin ab getötet und autolysiert; es findet demnach keine Antitoxinbildung durch das Milzgewebe in vitro statt. Auch die Lungen-, Nieren- und Herzexplantate von aktiv immunisierten Meerschweinchen bilden keine Antitoxine in vitro. Es muß aber erwähnt werden, daß auch im Plasma dieser Tiere kein Antitoxin, auch noch nicht nach der vierten subkutanten Toxininjektion, gefunden werden kann. A. A. Krontowski (552) setzte zu den Deekglaskulturen der Fibroblasten von Hühner- embryonen 1 : 105 bis 1 : 106 verdünntes Diphtherietoxin hinzu und beobachtete danach eine Verminderung des Wachstums um 48 bzw. 37 °/o gegenüber dem toxinfreien Milieu. Die Wachstumshemmung trat erst nach einer Latenzzeit von ca. 24 Stunden ein. Derselbe Effekt wurde auch bei Versuchen mit Dauerkulturen in Carrel-Flaschen erzielt, und zwar immer nach einer Latenzzeit. Der Versuch gelang, gleichgültig, ob man das Toxin von vornherein dem Nährboden zusetzte oder aber erst nach einer gewissen Zeit der normalen Entwicklung. Während die vergifteten Kulturen auch nach der Toxinentfernung dieselbe Wachs- tumshemmung aufweisen, zeigen die aus ihnen gewonnenen weiteren Subkulturen (öfter die zweiten, manchmal schon die ersten) eine Erholung. Allmählich holen sie das Wachstum der Kontrollkulturen nach. Es wird dabei von einer Reversibilität der Wachstumshemmung gesprochen. Die Erholung trat auch nach längerer Einwirkung von stärkeren Toxinkonzentrationen (0,1—0,5 °/o) auf. Das Diphtherietoxin hemmt auch nach einer Latenzzeit von 24 Stunden den Zucker- verbrauch und die Milchsäurebildung der Fibroblastenkulturen, sowie des nicht wach- senden Explantats aus dem Gehirn ausgewachsener Tiere (Krontowski u. Jazimirska- Krontowska (553)). Kontrollen Mit 0,15 °/o Toxins Zuckerverbrauch in mg % 73,0 49,5 Milchsäurebildung in mg % 23,1 10,8 Merkwürdigerweise üben die Streptokokken- und Ruhr-Shiga-Toxine keine solche Wirkung auf das Wachstum und den Kohlehydratstoffwechsel der Gewebe in vitro aus. A. Wadsworth und E. Hoppe (561) beobachteten, daß das Diphtherietoxin in vitro erst in höheren Konzentrationen die Gewebskulturen in vitro schädigen kann. Es wird in vitro nur durch das wachsende embryonale Herzgewebe des Meerschweinchens, nicht aber durch das Herzgewebe von erwachsenen oder fötalen Tieren entgiftet, irre- versibel gebunden oder zerstört. Die Atmungsgröße des überlebenden Lebergewebes von Ratten wird durch das Diphtherietoxin nicht verändert (Walthard (562)). Beim neuntägigen Hühnerembryo bewirkt das Diphtherietoxin die Entstehung von Nekrosen in Haut, Nieren, Leber und Chorio-Allantois. Es führt schließlich zum 74 Absterben des Embryos (F. L. Evans (551)). Die Hühnerembryonen erwiesen sich dabei dem Diphtherietoxin gegenüber viel empfindlicher als die Meerschweinchen- embryonen. Die Kulturen von Paramaecien (im Weizenwasser) wurden durch acht von neun geprüften Diphtherietoxinen in 3—5 Stunden getötet. Das Toxin des Stammes Park-Williams No. 8 wurde hierbei durch das Antitoxin noch bis zur Verdünnung von 1 : 18.000 vollkommen neutralisiert in dieser seiner Fähigkeit (Tunnicliff (558)). Dagegen erwiesen sich in Versuchen von Oehler (559) die Infusorien Colpoda Steini, Colpoda cucullus und Colpidium colpoda als dem Diphtherietoxin gegenüber un- empfindlich. Auf die Bakterien wirkt das Diphtherietoxin bei Konzentrationen von 30 Dlm pro 1 ccm deutlich wachstumshemmend; die Wirkung ist durch das Antitoxin neutralisier- bar. Es wurden folgende Bakterien in dieser Hinsicht geprüft; B. proteus vulgaris, Staphylococcus albus und B. cereus (Sherman und Stark, C. N. & P. W. (560)). ) 3. Wirkung auf die Gefäßwände — seröse Entzündung Den größten Fortschritt in der Erforschung der Pathogenese der allgemeinen Toxinschädigungen bei der Diphtherie, besonders bei ihren malignen, sog. „hyper- toxischen“ Formen, stellt u. E. die Übertragung des von H. Eppinger (570) geschaffenen Begriffs der „serösen Entzündung“ auf dieses Gebiet dar. Das an und für sich nicht richtige Wort, das sich trotzdem in der Literatur schon eingebürgert hat, bezeichnet einen pathologischen Zustand, bei dem die Wände der kleineren und kleinsten Blut- gefäße nicht nur für das Wasser und Elektrolyte, sondern auch für die Plasmaproteine durchlässig werden. Als Folge dieser Permeabilitätserhöhung der Gefäßwände kommt es zu einer Über- schwemmung des umliegenden Gewebes, in erster Linie des Bindegewebes, mit einer proteinreichen Flüssigkeit. Die Ansammlung der Eiweißstoffe des Blutplasmas im Gewebe führt zu einer durch erschwerte Gasdiffusion verursachten Störung der Sauerstoffversorgung des Parenchyms. Die Organzellen gehen in einen gezwungenen '■noxybiotischen Zustand über. Der Kohlehydratstoffwechsel erleidet eine Entgleisung, die zu einer Anhäufung von sauren Produkten im Gewebe führt. Infolgedessen kommt es zu einer Störung in der Elektrolytverteilung zwischen dem Plasma und der Ge- websflüssigkeit, — K wandert in die Blutbahn, Na und CI dagegen ins Gewebe. Diese Störungen werden von pathologischen Veränderungen des N-Stoffwechsels begleitet, die zu einer Erhöhung des Rest-N im Blut und Gewebe führen. Die Abwanderung von Plasma in das Gewebe hat die Verminderung der zirkulie- renden Blutmenge und eine Bluteindickung (Vermehrung der Erythrozytenzahl, des Hämoglobins und die Vergrößerung des Hämatokriwerts) zur Folge. Alle diese Störungen wurden zuerst von der Schule H. Eppingers an verschiedenen klinischen und experimentellen Kollapsformen verfolgt. Es entstand die Einteilung der Kollapsursachen in zwei große Gruppen: hämodynamische und protoplasmatische Bei den ersteren liegt der Schwerpunkt im Versagen der Herzaktion bzw. in einer abnormen Erweiterung der Blutgefäße in größeren Kreislaufregionen (besonders im Bereich der Organe der Bauchhöhle). Die protoplasmatische Kollapskomponente beruht auf der eben besprochenen Erhöhung der Kapillarendurchlässigkeit. In reinster Form tritt der „protoplasmatische“ Kollaps bei der experimentellen Vergiftung der Tiere mit Allylamin bzw. Allylformiat auf. Der Histaminkollaps tritt meistens unter Be- teiligung auch der hämodynamischen Komponente ein. 75 Zink (588) sah, daß bei den toxischen Diphtherieerkrankungen, ähnlich wie bei Ver- brennungen und bei der experimentellen Histamin Vergiftung die Wandungen der Blutkapillaren eine ödematise Schwellung aufweisen. Auch D. Tichomirow (586) konnte an sechs mit Diphtheriebakterien infizierten Meerschweinchen feststellen, daß bei ihnen außer den allgemeinen toxischen Veränderungen in Parenchymorganen beson- ders ausgesprochene Schädigungen an Kapillarendothelien und Endothelien der größeren Blutgefäße bemerkbar waren. Die Schädigung ging manchmal bis zur totalen Endothelzerstörung und konnte zur Erklärung des gleichzeitig beobachteten Vorhan- denseins der Diphtheriebakterien im Blut, sowie der starken inneren Blutungen heran- gezogen werden. G. W. Günther (574) untersuchte die Kollapserscheinungen beim diphtherievergif- teten Kaninchen. Er unterscheidet zwischen dem akuten Kollaps, der sich schnell nach der Vergiftung entwickelt und einem später auftretenden potrahierten Kollaps. Der akute Kollaps verläuft unter dem Bilde einer akuten Enteritis; bei der Autopsie fällt meistens die Hyperämie der Gedärme als Folge einer Kreislaufstörung in einem großen Gebiet des Magendarmkanals auf, während die anderen inneren Organe (Leber, Milz, Herz, Nieren, Nebennieren) anämisch sind. Bei später eingehenden Tieren spielt sich der krankhafte Prozeß in mehreren, aber kleineren Gefäßbezirken ab. Als Folge dieser Zirkulationsstörungen kommt es in ver- schiedenen Organen zu Schwellung und Nekrose der Parenchymzellen, zu sero- hömorrhagischer Entzündung und starker Infarktbildung. Eine Reihe von Arbeiten, besonders von J. Dieckhoff und J. Ströder hat die über- wiegende Rolle der Gefäßwandschädigungen bei toxischer Diphtherie außer Zweifel gestellt. J. Dieckhoff (566) beobachtete bei den diphtherievergifteten Kaninchen eine starke Verminderung der zirkulierenden Blutmenge. Dieckhoff führt sie auf Störungen im peripheren Kreislauf zurück. Auf der Höhe der Diphtherieerkrankung beim Kind (567) ist die zirkulierende Blut- menge stark vermindert; die Erythrozytenzahl ist vergrößert, das Blutplasmaeiweiß bleibt unverändert. Der Eiweißgehalt in der Flüssigkeit der Cantharidenblasen ist dabei vergrößert. Im Landysschen Stauungsversuch erkannte man, daß eine ver- stärkte Durchlässigkeit der Gefäßwände für die Plasmaproteine vorliegt. Ähnliche Erscheinungen kommen auch bei Scharlach- bzw. Ruhrintoxikationen vor. Wenn die zirkulierende Blutmenge infolge der Steigerung der Kapillarenpermea- bilität um 30—40 % vermindert ist, tritt beim Menschen und beim Tier die für die „seröse Entzündung“ charakteristische Elektrolytenverschiebung (Transmineralisie- rung) auf (569). Na und CI sind im Blutserum und Harn vermindert, im Gewebe, be- sonders in der Leber, angereichert. K verhält sich umgekehrt. Rest-N im Blut ist be- sonders auf Kosten des Harnstoff-N vermehrt. Die Versorgung der Gewebe mit Sauerstoff ist gestört. Die Differenz zwischen dem G2-Gehalt im arteriellen und venösen Blut wird kleiner; es wird weniger 02 in der Lunge aufgenommen, gleichzeitig aber auch weniger an das Gewebe abgegeben. Diese Stoffwechselstörungen sind nach Dieckhoff nicht ausschließlich „neben- nierenbedingt“, weil sie durch Nebennierenrindenpräparate nicht gebessert werden können. Nur die Blutgasveränderungen lassen sich durch die frühzeitige Percorten- therapie beeinflussen. Außerdem werden bei den „nebennierenbedingten“ Elektrolyt- verschiebungen Na und CI im Harn stärker ausgeschieden, während sie bei diph- therotoxischen Veränderungen auch im Harne weniger erscheinen, also in den Ge- weben retiniert werden müssen (568). 76 Nitschke und Krätschell beschreiben eine Reihe von Blutveränderungen bei den an toxischer Diphtherie erkrankten Kindern, die sie im Wesentlichen auf eine Neben- nierenrindeninsuffizienz zurückführen (577). Diese Veränderungen sind denen bei der erhöhten Kapillarenpermeabilität sehr ähnlich. Im einzelnen handelt es sich um: a) nicht regelmäßige, aber in den ersten Erkrankungstagen besonders häufige Erythro- zyten- bzw. Hämoglobinzunahme; b) manchmal gesteigerten Färbeindex (Zeichen der Wasserverarmung der Erythrozyten); c) eine Bluteiweißzunahme mit einer Verschie- bung des Serumproteinspektrums zugunsten des Albumins bei fast 25 °/o der Er- krankten; d) Steigerung des Blut-Rest-N; e) Zunahme der Blutalkalireserve (evtl, im Zusammenhang mit der Chloridabnahme); f) Blutkaliumzunahme. Dem letzten Symptom wird von Nitschke und Krätschell ein besonders großer Wert beigemessen, da es nur bei der Nebennierenrindeninsuffizienz zu einem so großen K-Zuwachs im Blute, wie bei der toxischen Diphtherie kommt. Es wurde von Nitschke (578) ein besonders nach seinem eigenen Verfahren hergestelltes Nebennierenrinden- präparat vorgeschlagen, das im Tierexperiment eine deutliche Abnahme des Blut- kaliums verursachte. Die Veränderungen im Elektrolytengehalt des Blutes bei diphtherievergifteten Meerschweinchen beschreiben auch F. Addari und F. Gottdenker (563). Sie fanden, daß schon 24—36 Stunden nach der subkutanen Einspritzung von 1 Dlm des Toxins, noch früher als an der Injektionsstelle sich ein Infiltrat bildet, der Blutchlorgehalt auf 15—25 °/o seines Anfangswerts absinkt. Dieses Minimum bleibt bis zum Tode des Tieres konstant. Dieser Chlorabnahme wird eine suprarenale Genese in Analogie mit Blutchlorschwankungen bei den Addisonkranken und nebennierenlosen Tieren zuge- schrieben. Starlinger und Winands (580) berichten über eine absolute und relative Vermeh- rung des Gesamtserumeiweißes bei Menschendiphtherie, besonders des Fibrinogens und Serumglobulins. Nach H, Gohr und W. Bolt (571) liegen die Werte für das Ge- samtserumeiweiß bei Diphtherie innerhalb der Norm. Der Gehalt an Albumin- bzw. Globulin ist uneinheitlich; ihr Verhältnis steht in keiner Beziehung zu der gewöhnlich bei der Diphtherie auftretenden Erhöhung der Erythrozyten-Senkungsgeschwindigkeit und der Verkürzung des Weltmannschen Koagulationbandes. Nach den Ergebnissen von G. Bonnet und M. Casassa (564) sind die Blutserum- globuline bei den Diphtheriekranken ständig vermehrt. Die Gesamtserumproteine, sowie das Albumin zeigen keine eindeutigen Veränderungen auf. Die Globulin- vermehrung (relative und absolute) dauert bis in die Rekonvaleszenz an. Wahrschein- lich hängt dieses Phänomen nicht so sehr mit der Gefäßpermeabilität als mit der spe- zifischen Abwehrtätigkeit des infizierten Organismus zusammen. Die Diphtherie- Toxine und Anatoxine verhindern die Gerinnung des Blutserums und des Serum- globulins bei ihrer Erhitzung, nicht aber die des Serumalbumins. Die gerinnungsver- hindernde Substanz ist mit dem Diphtherietoxin verbunden, scheint aber mit ihm nicht identisch zu sein. Die Hitzedenaturierung von Proteinen wird dabei nicht verhindert; nur ihre Ausflockung ist aufgehoben (Goldie (572)). Auch die Koagulation der Blut- plasma wird in Anwesenheit von Anatoxin, erhitzte Diphtherietoxins, sowie der ein- fachen Kulturbouillon verzögert oder aufgehoben. Die Wirkung beruht auf der In- hibition der Thrombinbildung im koagulierenden Blut (Goldie (573)). J. Ströder formuliert seine Auffassung über die Pathogenese der Kreislaufsstörun- gen bei toxischer Diphtherie folgendermaßen: „In den ersten Diphtherietagen kommen die Kinder vorwiegend an einem Ver- sagen des peripheren Kreislaufs zu Tode. Vasomotorenzentrum, sowie die sympathi- schen Nervenausbreitungen in der Gefäßwand sind der Angriffspunkt des Diphtherie- toxins. Der Gefäßtonus läßt nach. Die Eingeweidegefäße sind überfüllt, die peripheren laufen leer. Der Rückstrom des Venenblutes zum Herzen ist mangelhaft. Das ist der 77 „hämodynamische“ Kollaps. Aber außerdem kommt es im Bereiche der terminalen Gefäße zu einer Erhöhung der Permeabilität der Gefäßwände, gefolgt von einem Plasmaeiweißaustritt in das Gewebe.“ Die Rolle dieser zweiten „protoplasmatischen“ Komponente bei der Diphtherie- intoxikation belegt Ströder (581—583) durch folgende Experimente: 1. Das intravenös gegebene artfremde Serum verschwindet bei einer Diphtherie- intoxikation schneller aus der Blutbahn als sonst (585). 2. Die Übertrittsgeschwindigkeit des artfremden Serums aus dem Blut in den Liquor ist gesteigert. Auch der Übertritt in umgekehrter Richtung Liquor-Blut ist beschleunigt (584). 3. Cantharidenblasenflüssigkeit enthält mehr Eiweiß als sonst. 4. Die disseschen Räume in der Leber sind mit Eiweiß überfüllt. Die zentralen Leberläppchenteile sind stark hyperämisch — „Hepatitis serosa“ von H. Eppinger. 5. An den isolierten und mit Nornosallösung durchströmten Kaninchenohren ist 48 Stunden nach der Diphtherievergiftung des Tieres eine erhöhte Kapillarendurch- lässigkeit für Wasser und Salze, ohne gleichzeitige Gefäßerweiterung festgestellt worden (583). 6. Die Permeabilität der mit dem Diphtherietoxin vergifteten Erythrozyten für das Glyzerin und Erythrit ist verstärkt. Für Glukose bleibt sie unverändert. Ebenfalls be- merkt man keine Differenz in der Permeabilitätsgeschwindigkeit der toxinvergifteten und der normalen Erythrozyten für lipophyle Farbstoffe und einige Anionen. Aus diesen letzten Beobachtungen wird der Schluß gezogen, daß wenigstens bei den Erythrozyten die gefundenen Permeabilitätsstörungen weder mit einer Verände- rung der Einweiß- noch der Lipoidkomponente ihrer Membranen im Zusammenhang stehen können. Es wird eine Störung der „physiologischen Membranpermeation“ im Sinne R. Höbers angenommen. Diese Störungen sollen durch Veränderungen im kol- loidalen Zustande des Zytoplasmas und seiner Oberflächenschicht bedingt sein. Nach allen diesen Befunden und Erwägungen sieht Ströder die Möglichkeit, gewisse Parallelen zwischen der Diphtherieintoxikation und anaphylaktischen Erscheinungen, sowie der „serösen Entzündung“ zu ziehen. Eine andere Ausdrucksform der Gefäßwandschädigung bei Diphtherie liegt bei den in verschiedenen Organen vorkommenden Hämorrhagien vor. Über die Klinik dieses Symptoms hat in der letzten Zeit besonders ausführlich P. v. Kiss (576) berichtet. Cassoute u. a. (565) haben fast immer bei den diphtheriekranken Kindern eine ver- längerte Blutungszeit gesehen. Besonders häufig sind die von J. Sampedro (579) beim Meerschweinchen und von T. Yokoyama (587) beim Kaninchen, von Hanke (575) bei Katzen und Menschen fest- gestellten, bei der Diphtherieintoxikation auftretenden Blutungen und Geschwüre an der Schleimhaut des Pylorus zu erwähnen. Damit waren die älteren Befunde von Rosenen und Andersen, sowie von Neisser und Gins (1913) beim Menschen bestätigt. Sampedro konnte bei zwei mit je 0,4 ccm einer l°/oigen Diphtherietoxinlösung vergif- teten Meerschweinchen außer starker Hyperämie und Blutungen in Nebennieren, Nieren und Leber auch eine hämorrhagische Pyloritis beobachten, die durch die Ab- schuppung der oberen Epithelschichten, Schwund des Zottenskeletts und eine An- reicherung von eosinophylen Zellen charakterisiert war. Er wies bei dieser Gelegen- heit auf große Ähnlichkeit dieser diphtherietoxischen Pylorusschädigungen mit be- ginnendem Magenulcus hin. Endlich deutet auch die bei der Diphtherieintoxikation von Meerschweinchen be- sonders oft vorkommende Flüssigkeitsansammlung in den serösen Körperhöhlen auf eine stärkere Schädigung der Gefäßwände hin. 78 4. Wirkung auf die Nebennieren. Beteiligung der Ascorbinsäure, Adrenalins, Glutathions usw. Eine ebenso wichtige Rolle wie den Gefäßwandschädigungen kommt bei der Diph- therieintoxikation des Menschen und einiger Tiere (Meerschweinchen, Kaninchen) den Veränderungen in den Nebennieren zu. Bevor man über die große Bedeutung der Gefäßpermeabilität bei dem Zustandekommen von einigen bakteriellen Intoxikationen genauer unterrichtet wurde, hat man die Mehrzahl der bei ihnen beobachteten physio- logischen und biochemischen Abweichungen durch das Versagen der Nebennieren, insbesondere ihrer Rinde, zu erklären versucht. Die Verhältnisse sind auch jetzt nicht eindeutig aufgeklärt. Man kann annehmen, daß die beiden Schädigungsgruppen eng miteinander verknüpft sind. Die Nebennieren sind durch ihren Reichtum an Adrenalin und Ascorbinsäure gekennzeichnet. Dem ersteren kommt, wie bekannt, unter anderem auch eine wichtige Rolle des physiologischen Regulators des Gefäßlumens zu; Ascor- binsäure ist zum Aufrechterhalten der normalen Beschaffenheit notwendig, was be- sonders deutlich am Auftreten von Hämorrhagien bei Skorbut zu sehen ist. Der Mechanismus der physiologischen Lenkung der Kapillarenpermeabilität ist noch unbekannt. Es kann auch sein, daß die beiden Nebennierenkörper (eventuell im Zusammenwirken mit dem Corticosteron) an diesem Regulationsvorgang beteiligt sind, und das Ausfallen oder die Beschädigung der Nebennieren durch Störungen in dem Stoffwechsel gerade dieser beiden Körper die Gefäßpermeabilität beeinflussen kann. Die Stoffwechselanomalien, die von Bamberger und Never (594) bei den diphtherie- kranken Kindern beobachtet wurden, sind folgende: a) Nebenniereninsuffizienz-Erscheinungen: negative Chlor- und Natrium-Bilanz, Hypochloraemie, Azotaemie, besonders Uraemie, Erhöhung des Blutphosphat-Titers, Hyperlaktacidaemie, Erhöhung der Erythrozytenzahl, des Haemoglobins; Abnahme der Blutkohlensäure und des Blutcalciums, sowie eine Hypoproteinaemie (im Gegensatz zu der typischen Nebenniereninsuffizienz). b) Störungen der Nierenfunktion: Nierensperre für Harnstoff und Wasser. c) Leberschädigung: Ikterus und das Auftreten des rotgelben Pigments im Serum. d) Fehlleitung des Kohlehydratstoffwechsels: Störung der Veresterungsprozesse beim Glykogenabbau, Schädigung der Myokardfunktion. e) Verringerung des Plasma Volumens: Hypothermie der Haut, Blutdrucksenkung. Während bei den diphtherieempfindlichen Meerschweinchen, Hunden und Menschen frühzeitig ein Versagen des Kreislaufs und der den Blutdruck aufrechterhaltenden endokrinen Organe (Nebennieren, Hypophyse) eintritt und das klinische und patho- logisch-anatomische Bild beherrscht, fehlen alle diese Erscheinungen bei der Diph- therieintoxikation von viel resistenteren weißen Mäusen. Die Mäuse zeigen vor allem Schädigungen des Zentralnervensystems auf, von einer schweren Ataxie gefolgt, die die Tiere zur Nahrungsaufnahme unfähig macht und zum Kachexietod führt (Ulrich (679)). Die Nebennieren erleiden bei der experimentellen Diphtherieintoxikation, sowie bei den toxischen Diphtherieerkrankungen des Menschen tiefgehende Schädigungen. Wie schon die älteren Autoren beschrieben haben (Roux und Yersin, Oppenheim und Loeper (655), Levy (638), Abramow (589), Leede (637), Strubell (667) u. a. sind die Neben- nieren bei diphtherievergifteten Tieren und bei an Diphtherie verstorbenen Kindern vergrößert, hyperämisch und mit Blutungen durchsetzt. A. Dietrich (612) und M. Wülfing (687) sahen, daß die ersten histologischen Veränderungen in der Nebennierenrinde in einer Verkleinerung der Lipoidtröpfchen in ihren Zellen bestehen, die bis zum vollen 79 Lipoidschwund gehen können. Weiter werden die Zellen stark vakuolisiert; es entsteht das Bild einer „wabigen Degeneration“. Endlich kommt es zum Zellzerfall und zur Zellkernauflösung. Gleichzeitig treten lokale Zirkulationsstörungen (Hyperämie, Ödeme, Blutungen, Infarkte) auf. Diese Befunde wurden bei vielen Infektionen er- hoben, sind aber bei Diphtherie und Scharlach am häufigsten. Die pathohistologischen Veränderungen am Nebennierenmark betrachtet Dietrich als von recht problemati- scher Natur. Auch H. Lotze und S. Thaddea (645) sowie Hartmann A. Macdonald (626) berichten über sehr frühzeitig bei Diphtherieintoxikation eintretende Blutungen, Nekrosen und Lipoidschwund in der Nebennierenrinde. Maclean (648) fand an den Nebennieren der an toxischer Diphtherie verstorbenen Kinder eine trübe Schwellung des Parenchyms und zahlreiche Blutungen, was bei den an weniger toxischem Diphtheriekrupp Ver- storbenen nicht der Fall ist. G. Mouriquand u. a. (650—652) sahen, daß in den Neben- nieren der diphtherievergifteten Tiere der Cholesteringehalt erniedrigt ist. Diese Beobachtungen hat auch J. Dieckhoff (604) bestätigen können; außerdem sah er, daß diese Nebennieren Veränderungen bei den mit dem Desoxycorticosteronacetat (Percorten) behandelten Tieren viel weniger ausgeprägt waren. Histochemisch wurde außer dem obenerwähnten Lipoidschwund in der Nebennieren- rinde noch eine verstärkte Plasmalreaktion nach Feulgen beschrieben (Tonutti (673)). Diese Reaktion weist auf die Anwesenheit von Phosphatiden hin, die eine Acetalgruppe besitzen. Diese Reaktion wurde in der Nebennierenrinde auch nach dem Zuführen von corticotropem Hormon der Hypophyse beobachtet. Geringer Ascorbinsäuremangel ebenso wie die Zufuhr von kleinen Mengen dieser Säure rufen keine Veränderungen in der Intensität der Feulgenschen Reaktion in Nebennieren hervor. Tonutti glaubt, daß die Verstärkung dieser Reaktion bei der Diphtherieintoxikation auf einer Aus- schüttung des corticotropen Hypophysenhormons ins Blut beruht, die von einer Akti- vierung der Nebennierentätigkeit gefolgt ist. Auch W. Gramer (602, 603) hat auf histo- chemischem Wege die erhöhte Aktivität der Nebennieren bei der Diphtherieintoxi- kation nachgewiesen. Was das Adrenalin betrifft, sah noch R. Ehrmann (615) nach einer Diphtherie- intoxikation beim Kaninchen eine gesteigerte Adrenalinsekretion in das Venenblut (gemessen an der Pupillenreaktion des enukleierten Froschauges auf den Zusatz vom Blut aus V. cava inf, des Versuchstieres). K. Pesch und K. Strelow (659) beobachteten, daß das Nebennierenmark (auch gekochtes) das Wachstum der Diphtheriebakterien hemmt; Nebennierenrinde verhielt sich indifferent. G. Mouriquand, P. Sedaillan und Coeur (650) fanden, daß nach einer Diphtherieintoxikation die Nebennieren an Adre- nalin und Ascorbinsäure verarmt sind. Die Verringerung ihres Adrenalingehalts be- ginnt erst nach zehn Stunden nach der Vergiftung und erreicht ihren Höhepunkt von der 16. Stunde ab. Mutow (653) bestätigte diesen Befund. Er sah, daß die Adrenalinabnahme in Neben- nieren durch die Durchschneidung von nn. splanchnici verstärkt wird. Im Gegensatz dazu konnte Ashford (592) 24—48 Stunden nach einer intraperitonealen Injektion von Diphtherietoxin beim Meerschweinchen keine größere Erniedrigung des Adrenalin- titers in ihren Nebennieren gegenüber den Kontrolltieren feststellen. Die toxischen Di-Kulturen zerstören die blutdrucksteigernde Wirkung des Adre- nalins. Es sind aber daran weder das Di-Toxin noch die pH-Verhältnisse, vielmehr aber die in den Kulturen vorhandenen Bakterien-Nukleproteine beteiligt (v. Gröer und Hecht (622)). Der Gehalt der Nebennierenrinde beim Meerschweinchen am Corticosteron wurde von A. und P. Giroud und M, Martinet (620) nach der Injektion von einigen letalen Dosen von Diphtherie- oder Tetanustoxinen untersucht und kurz vor dem Tode des Tieres um Vs bis Vs niedriger als in der Norm gefunden. 80 In diesem Zusammenhänge sind die Befunde von J. Dieckhoff (605) von beson- derem Interesse, der im Serum von diphtherievergifteten Kaninchen eine dialysier- bare Substanz fand, die bei den Meerschweinchen gewisse Veränderungen an den Nebennieren hervorrufen könnte. Nach einer Cortidyn-Behandlung verschwindet diese Substanz aus dem Serum. Der Verfasser bringt diese Substanz mit der Schädigung der Kaninchennebennieren durch das Diphtherietoxin in Verbindung. Bei diphtherie- kranken Kindern vermochte Dieckhoff das Auftreten einer solchen Substanz im Serum nicht nachzuweisen. Spritzt man Meerschweinchen solche Kinderseren ein, so treten bei ihnen in den Nebennieren Blutungen und Nekrosen auf, die auch mit dem Serum der Cortidyn behandelten Kranken erzielt werden können. Dieser Effekt ist wahr- scheinlich durch das bei 17 von 38 solcher Kinder im Serum nachgewiesene Toxin zu erklären. Maclean (648) weist auf folgende, wahrscheinlich durch diphtherietoxische Neben- nierenschädigung bedingte Diphtheriesymptome hin; a) geringe Steigerung der Körper- temperatur; b) erniedrigter Blutdruck; c) allgemeine Asthenie mit der Neigung zum Kollabieren; d) Übelkeit, Erbrechen; e) Bauchschmerzen; f) Gedächnisstörungen; g) Blutzuckererniedrigung; h) Wasserretention; i) Na- und Cl-Abnahme und K-Zu- nahme im Blut. Nach P. Bamberger, Never und Oelkers (593) führt die bei der Diph- therie vorkommende Hypochlorämie zur Erhöhung des Rest-N in Blut und Gewebe (ähnlich wie bei dem hypochlorämischen Pylorospasnus, der auch zu einer Azotämie führt). Ascorbinsäure in Nebennieren. E. Harde (624) sah, daß die Nebennieren der Kanin- chen nach einer Diphtherieintoxikation an Ascorbinsäure verarmten; bei den toxin- resistenteren Mäusen war das schwächer ausgeprägt. Cardoso (601) hat festgestellt, daß die Nebennieren der diphtherievergifteten Meerschweinchen ihre Fähigkeit Silber- nitrat zu reduzieren verloren haben. Er erklärt das mit einer Zerstörung der Ascorbin- säure in den Nebennieren durch das Diphtherietoxin. Nach einer Diphtherieintoxika- tion ist die Abnahme von Ascorbinsäure in Nebennieren, Pancreas und Nieren (im Mittel um 38,25 und 21 % des Normalwerts) auch von Lyman und King (647) nachge- wiesen worden. In der Leber wurden die reduzierenden Substanzen manchmal ver- mehrt. Auch J. Kligler, J. Leibowitz und M. Berman (274) beobachteten bei diphtherie- vergifteten Meerschweinchen eine starke Ascorbinsäureabnahme in den Nebennieren; die Säure verschwand bei Anwendung von letalen Dosen vollständig (siehe auch S. Thaddea und W. Hofmeister (672), Harris u. a. (625)). C. Torrance (674) spritzte den Meerschweinchen Vs Dlm Diphtherietoxin ein und beobachtete nach 24 Stunden zuerst eine Steigerung des Ascortainsäuregehalts ihrer Nebennieren um ca. 60% über die Norm. Nach weiteren 24 Stunden stieg die Ascor- binsäure weiter an und ging erst nach 72 Stunden wieder zurück, aber nicht bis zur Norm. Bei vier Tieren blieb am sechsten Tage, als die Nekrosen in den Nebennieren schon ausheilten, der Ascorbinsäuretiter noch um ca. 270 % über dem bei den Kon- trollen. Bei einem Meerschweinchen, das nach 1 Dlm einging, war die Ascorbinsäure in den Nebennieren um 15 °/o erniedrigt. In weiteren Versuchen (675) sah Torrance, daß die Blutungen in den Nebennieren bei diphtherievergifteten Meerschweinchen desto stärker wurden, je niedriger ihr Gehalt an Ascorbinsäure war. Wenn man gleich- zeitig mit dem Diphtherietoxin Ascorbinsäure darreichte, waren die Hämorrhagien weniger ausgedehnt. Torrance vermutet, daß die Ascorbinsäure in den Nebennieren durch das Diphtherietoxin zerstört wird. In neuester Zeit (676) fand er, daß die nie- drigste Toxindosis, die den Ascorbinsäuretiter in den Nebennieren noch verringern kann, der Dlm des Toxins für einige Tiere entspricht. Ihre Größe schwankt bedeutend, je nach der Tierempfindlichkeit. Haas (623) stellte bei Meerschweinchen, die eine ascorbinsäurereiche Nahrung er- hielten, fest, daß der Ascorbinsäuregehalt ihrer Nebennieren 1—2 Tage nach Ein- 81 Spritzung von Vs Dlm des Diphtherietoxins deutlich abnahm. Bei den Tieren aber, die eine ascorbinsäurearme Diät erhielten und deren Nebennieren an Ascorbinsäure arm waren, ließ sich dieser Ascorbinsäureschwund nicht feststellen. Eine Ascorbinsäure- steigerung wurde nach einer Diphtherievergiftung, auch vorübergehend, nicht be- obachtet. Im Gegensatz dazu konnte Parvis (658) keinen Zusammenhang zwischen den ge- ringen jahreszeitlichen Schwankungen des Ascorbinsäuregehalts in verschiedenen inneren Organen von Meerschweinchen und ihrer Empfindlichkeit gegenüber dem Diphtherietoxin feststellen. Eine interessante Auffassung über die Bedeutung dieser Ascorbinsäureschwan- kungen in den Nebennieren bei der Diphtherieintoxikation hat Kossei (634) heraus- gebracht. Er sah in den Nebennieren der skorbutkranken Meerschweinchen Erschei- nungen auftreten, die denjenigen bei einer Diphtherieintoxikation weitgehend ähnlich waren. Er betrachtet Skorbut als eine C-Avitaminose ex alimentatione, die Diphtherie- vergiftung als eine solche ex consumptione. Andererseits erwägt er die Möglichkeit, daß der Ascorbinsäureschwund für die Nebennieren eine typische und für sie charak- teristische Reaktionsform auf verschiedentliche Schädigungen sein könnte. Außer den Nebennieren kommt es im Verlaufe der Diphtherieintoxikation auch zu Ascorbinsäureschwankungen im Blut und Harn. Nuzzi (654) beobachtete bei einer töd- lichen Diphtherievergiftung der Meerschweinchen Ascorbinsäure Vermehrung in Blut und Milz. Salassa (660) beobachtete bei den Diphtheriekranken, daß der Ascorbinsäuretitcr im Blut gegenüber der Norm erhöht war, und zwar am Anfänge der Erkrankung stärker als in der Rekonvaleszenz. Diese Veränderung war von der Schwere dar Erkrankung unabhängig. Am Tier sah B. Ghosh (618, 619), daß nach einer Diphtherie- intoxikation der Ascorbinsäuregehalt im Blut, Leber, Nieren und Nebennieren vermin- dert war. Die Ausscheidung der Redform der Ascorbinsäure im Harn sank ab; die Gesamtascorbinsäure im Harn (Red 4 Ox-Formen) war gesteigert. Dagegen konnten H. Hertel und L. Arnold (629) bei 23 Diphtheriekranken keine Veränderungen in der Serum- und Harnascorbinsäure finden. Kündiger und Salus (636) sahen bei den Dipn- therieerkrankungen eine Verminderung der Ascorbinsäureausscheidung im Harn, die der Schwere der Erkrankung parallel verlief. Wenn der Ascorbinsäuredefizit bei leich- ten Fällen groß ist, so ist das als Zeichen einer noch vor der Diphtherieerkrankung vorhandenen C-Hypovitaminose anzusehen. Beim Auftreten von Serumexanthem wird der Ascorbinsäuredeflzit noch gesteigert. Woldrich und Lorentz (686) fanden im Gegen- satz dazu, daß die Ascorbinsäureausscheidung im Harn bei schwerer Diphtherie zu Beginn der Erkrankung vergrößert ist, später aber abnimmt. Belastet man in diesem Stadium den Kranken mit Ascorbinsäure, so steigt die Ausscheidung dieser Säure wieder an. Die fortlaufende Ascorbinsäurezufuhr kann ihre Verluste im Verlaufe der Erkrankung kompensieren. Die Frage der Ascorbinsäure bei der experimentellen und klinischen Diphtherie- intoxikation gewann mit der Zeit eine größere Bedeutung, als von vielen Seiten über erfolgreiche Versuche der prophylaktischen und terapeutischen Beeinflussung der Diphtherie durch Ascorbinsäure (besonders in Kombination mit dem Nebennieren- rindenhormon) berichtet wurde. Wir beschränken uns in dieser Übersicht hauptsäch- lich auf die beim Tier gewonnenen Ergebnisse. In der Klinik wandelte sich die an- fangs geäußerte optimistische Einstellung gegenüber dieser neuen therapeutischen Methode mit der Zeit, als die Berichte über die klinischen Mißerfolge sich mehrten. Man kann von den die Aussichten solcher Therapie günstig beurteilenden Autoren — Bamberger u. a. (595, 596), Kumagai u. a. (635), S. Thaddea (671), Bernhardt (597), Maclean (648), F. Szirmai (668) u. a. nennen. 82 Negativ dieser Methode gegenüber verhalten sich — S. Werner (683), H. Otto (657), Steinhardt und Türk (666), G. Tron (678), Zischinsky (690), Engelhardt (616), J. Dieck- hoff und K. Schüler (611) u. a. J. Pakter und B. Schick (443), Widenbauer und Saretz (685) konnten mit verschie- dentlich applizierten Ascorbinsäuredosen keinen Umschlag der positiven Schickreak- tion bei Kindern erzielen. Wie schon im Kapitel über das Diphtherietoxin erwähnt wurde, haben die Lösun- gen der Ascorbinsäure, sowie des neutralen Na-ascorbinats die Fähigkeit das Diph- therietoxin vermöge ihrer Redoxsubstanznatur in vitro zu entgiften. P. Polonyi (445) fand, daß Ascorbinsäure bei Diphtheriekulturen den Verlust ihrer Virulenz sowie des Hämolysevermögens verursacht. Gleichzeitig nimmt die Reduk- tionskraft der Ascorbinsäurelösungen ab. Dasselbe hat auch J. v. Gagyi (617) ge- sehen; in der Rekonvaleszenz soll nach ihm die Empfindlichkeit der Diphtheriebak- terien gegenüber der Ascorbinsäure abnehmen, sie werden gleichzeitig auch immer weniger virulent. Die für Ascorbinsäure empfindlichen Keime haben die Fähigkeit, die Ascorbinsäure selbst in vitro zu zerstören. Diese ascorbinsäurezersetzende Fähigkeit kommt auch dem Diphtherietoxin zu. Wie C. Torrance (677) feststellte, sinkt im Gemisch des Na-ascorbinats und Diphtherie- toxins innerhalb des pH des Säugetiergewebes bei 37 ° seine Reduktionsfähigkeit deut- lich ab. Das soll auf einer Ascorbinsäuredehydrierung beruhen. Das gekochte Toxin hat dieselbe Wirkung in vitro gezeigt. Während aber das native Toxin beim Meer- schweinchen zu einer deutlichen Ascorbinsäureabnahme in den Nebennieren führt, bleibt die Einspritzung von gekochtem Toxin ohne solche Wirkung. Die durch das Diphtherietoxin bewirkte Ascorbinsäureoxydation in vitro ist von reversibler Natur, schreitet also nur bis zur Stufe der Dehydroascorbinsäure vor. I Wir konnten uns ebenfalls in einigen unveröffentlichten Versuchen davon über- zeugen, daß das von uns verwendete Toxin in den Lösungen der Ascorbinsäure in vitro (bei pH = 4) eine Beschleunigung ihrer Autooxydation an der Luft bewirkt. Da diese Förderung der Ascorbinsäure-Autooxydation in Anwesenheit von KCN fast komplett gehemmt wurde, konnte man vermuten, daß es sich hierbei um eine durch Schwermetallspuren (in erster Linie durch Kupferspuren im destillierten Wasser) be- wirkte Autooxydation der Ascorbinsäure handeln muß. Das Diphtherietoxin könnte dabei die Rolle eines unspezifischen kolloidalen Proteinträgers spielen, der die oxy- dierende Wirksamkeit des Kupfers u. a. steigern könnte. Ob das Diphtherietoxin auch in vitro, etwa im kreisenden Blut und in den inneren Organen, irgendwelche Veränderungen im Oxydationszustand der Ascorbinsäure oder in ihren Bindungsformen auszuüben vermag, kann nur die weitere Forschung ergeben. Noch vor der Identifizierung der Ascorbinsäure als Vitamin C haben P. Kesch and K. Strelow (1. c) nachgewiesen, daß das Nebennierenmark bei gleichzeitiger Injektion mit dem Diphtherietoxin den Tod der vergifteten Tiere hinausschiebt. Die Neben- nierenrinde blieb dabei wirkungslos, wenn sie vom Toxin getrennt an einer anderen Stelle einverleibt wurde. Zusammen mit dem Toxin gespritzt wirkte sie lebens- rettend. J. A. Arkwright und S. Zilva (591) sahen, daß die skorbutkranken Meer- schweinchen die subkutane Toxinvergiftung schlechter vertrugen und schneller zu- grunde gingen. (Siehe auch Bieling (599)). E. Molinelli (649) beobachtete, daß die neben- nierenlosen Tiere eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber dem Diphtherietoxin auf- weisen. Nachdem die Ascorbinsäure chemisch rein dargestellt wurde, begann eine ganze Reihe von Untersuchungen, die den Einfluß der vorausgehenden, gleichzeitigen oder nachträglichen Darreichung von Ascorbinsäure auf den Verlauf der Diphtherieinfek- tion- und intoxikation beim Tier verfolgten. Hierbei wurde diese Säure öfter gemein- sam mit dem Nebennierenrindenhormon appliziert. 83 Als erste beobachtete E. Harde (1. c.), daß bei gleichzeitiger Zufuhr von 1 Dlm Diphtherietoxin und 10 mg Na-ascorbinats per os oder subkutan (mit nachfolgender Behandlung mit 15—20 mg dieser Substanz pro Tag), die Hälfte der Tiere am Leben blieb. Man dachte zuerst an die Fixation des Toxins an der Injektionsstelle durch Ascorbinsäure, die die Kapillarenpermeabilität vermindert und dadurch die Toxin- resorbtion verlangsamen kann. Wurde die Ascorbinsäure vor der Toxininjektion ge- geben, konnte man aber keine Schutzwirkung feststellen (E. Harde und M. Philippe (416)). Weiterhin fütterten C. K. Greenwald und E. Harde (412) die Meerschweinchen täg- lich mit je 10—20 mg Ascorbinsäure im Laufe von 1—2 Tagen vor der Vergiftung mit 1 Dlm Toxins. Die Tiere blieben am Leben, besonders wenn sie auch nachträglich mit Ascorbinsäure behandelt wurden. In Injektionen dargereicht blieb die Ascorbinsäure wirkungslos. C. W. Jungeblut und R. L. Zwemer (419) sahen, daß die während sechs Tagen mit Ascorbinsäure bzw. Na-ascorbinat vorbehandelten Meerschweinchen auf eine intraku- tane Injektion von Diphtherietoxin (0,02 Dlm) nicht mit einer Hautreaktion antwor- ten. Bei gleichzeitiger subkutaner Einspritzung an zwei verschiedenen Stellen von 2 Dlm Toxins und 1—200 mg Ascorbinsäure blieb die Hälfte der Tiere am Leben. Eine Beziehung zwischen der Überlebensquote und Ascorbinsäuredosis war nicht fest- zustellen. Wurden den Tieren gleichzeitig Cortin und Diphtherietoxin gegeben, so be- nötigte man 100—200fache Dosis von Cortin, um die Tiere zu schützen, verglichen mit der für die Toxinentgiftung in vitro benötigten Cortinmenge. Bei 1—2 Tage mit Cortin vorbehandelten Tieren blieben die Hautreaktionen auf das Toxin aus. R. Whitehead und C. A. Fox (684) fanden, daß bei 105 mit letalen Dosen des Diph- therietoxins vergifteten Meerschweinchen die Behandlung mit dem Cortin keinerlei Schutzwirkung ausübte; trotzdem beobachtete man eine gewisse Verlängerung der Lebensdauer. O. Grooten und M. Bezsonoff (414) haben bei Verwendung von schwachen (in neun Tage die Tiere tötenden) Toxindosen die Hälfte der Tiere durch gleichzeitige Injektion von Na-ascorbinat gerettet. Sie denken aber nicht an eine direkte Toxinentgiftung durch Ascorbinsäure in vivo, sondern glauben vielmehr an ihre abwehrsteigernde Einwirkung auf den Gesamtorganismus. Bei den durch ungenügende Zufuhr von Ascorbinsäure „präskorbutisch“ gemachten Meerschweinchen tritt der Diphtherietod schneller als bei den normal ernährten ein (King und Menten (632)). Nach L. Weed und Fenlon (682) treten bei den skorbut- kranken Meerschweinchen die Hautreaktionen auf Diphtherietoxin 1—2 Tage später auf als bei normalen oder präskorbutischen. Blutungen und Nekrosen an der Injek- tionsstelle des Toxins sind bei den skorbutkranken Tieren besonders stark ausgeprägt; 02-Verbrauch ihrer Leber und Nieren ist um 10—15 °/o erniedrigt. Dasselbe konnten auch J. v. Gagyi, A. v. Jeney und B. Baranyai (631) bestätigen. Erhielten die auf der Skorbutdiät gehaltenen Meerschweinchen vom dritten Diättag ab täglich eine Zulage von 1—2 mg Ascorbinsäure oder Na-ascorbinat, so wurde ihre Resistenz gegenüber dem Diphtherietoxin größer als bei den skorbutkranken Kontrollen. Bei behandelten Tieren wurden die diphtherietoxischen Veränderungen in Nebennieren, Hypophyse, Corpus luteum (besonders an Ascorbinsäure reichen Organen) geringer als bei den Skorbuttieren. Die Geschwüre an der Injektionsstelle bildeten sich bei ihnen eher, blieben aber mehr an der Oberfläche und heilten schneller als bei den Skorbutkon- trollen aus. Bei den ungenügend mit Ascorbinsäure versorgten Tieren (0,5 mg pro Tag), die mit Diphtherietoxin vergiftet waren, war die Gewichtsabnahme stärker als bei den aus- reichend mit Ascorbinsäure versorgten Tieren — 5 mg täglich — (A. Sigal und C. G. King (467)). Auch die bei der Diphtherieintoxikation vorkommenden Veränderungen im Kohlehydrat-Belastungsversuch waren bei den ungenügend mit Ascorbinsäure ver- 84 sorgten Tieren stärker ausgeprägt. Nach Angaben von H. Bock und H. Großmann (600) erwies sich eine Dosis von 10 mg Ascorbinsäure täglich beim Meerschweinchen als die vor einer Diphtherieerkrankung optimal schützende; schon 30 mg zeigten eine weniger günstige Wirkung. Im Gegensatz zu diesen positiven Ergebnissen mit der Ascorbinsäure konnten Schwarz und Cislaghy (465), H. Weber (681), sowie S. Zilva (689) keine schützende Wir- kung der Ascorbinsäure der Diphtherieintoxikation den Meerschweinchen gegenüber festsrtellen. E. Berger (598) konnte keinen Unterschied in der Überlebensdauer der diphtherievergifteten Meerschweinchen beobachten, gleichgültig ob sie normal ernährt waren (Ascorbinsäure in ihren Nebennieren — ca. 40 mg °/o) oder sich im präskorbuti- schen (Ascorbinsäure in Nebennieren = 3—5 mg °/o) oder skorbutischem (Ascorbin- säure in Nebennieren = 0) Zustande befanden. Wurde einigen Tieren gleichzeitig mit dem Toxin Ascorbinsäure oder Pancortex gegeben, so konnte trotzdem bei ihnen keine Lebens Verlängerung beobachtet werden. Auf Grund dieser Beobachtungen wird die Beeinflussung der experimentellen Diphtherieintoxikation durch Ascorbinsäure und Cortin abgelehnt. Man muß aber bemerken, daß die Anzahl der in diesen wie auch in einigen anderen diesbezüglichen Versuchen verwendeten Tiere so klein war, daß eine statistische Sicherung und Beurteilung ihrer Ergebnisse sehr erschwert ist. Was die nachträgliche Behandlung der diphtherievergifteten Tiere anbetrifft, be- obachtete P. Polonyi (1. c.), daß bei den behandelten Tieren die Krankheitssymptome schwächer waren und manche Tiere die Vergiftung überleben können. S. Thaddea (669, 670) fand bei den mit dem Diphtherietoxin schwer vergifteten Meerschweinchen, bei denen der Tod in 50 Stunden eintrat, außer ausgedehnten Blutungen und Nekrosen in der Nebennierenrinde, noch die weitgehenden Störungen im Kohlehydratstoff- wechsel (Verschwinden des Leberglykogens, Verminderung des Milchsäuregehalts im ruhenden und tetanisierten Muskel, starke Kreatinurie). Bei einer kombinierten As- corbinsäure + Cortin-Behandlung blieben die Tiere am Leben, die Veränderungen in der Nebennierenrinde, sowie im Kohlehydratstoffwechsel blieben aus. Cortin allein erwies sich als unwirksam. Große Dosen von Ascorbinsäure führten gelegentlich zum Überleben von Tieren. Die Wirkung der Ascorbinsäure t Cortin-Therapie wird von Thaddea (669) als unspezifisch betrachtet; es muß dabei zu einer Erhöhung der allgemeinen Widerstands- fähigkeit des Tierorganismus gegenüber Schädigungen verschiedenster Art kommen. Daß bei diesen Prozessen das Retikulo-Endothel beteiligt ist, beweist das Ausbleiben der Heilwirkung der Ascorbinsäure + Cortin-Therapie bei den mit Elektrokollargol intravenös vorbehandelten Tieren. Eine ähnliche lebensverlängernde, manchmal auch lebensrettende Wirkung bei diphtherievergifteten Tieren wurde auch bei ihrer Behandlung mit Zystein, Glutathion und Detoxin beobachtet (H. Lotze und S. Thaddea (646), S. Thaddea und Hofmeister (672)). Mehrere Aminosäuren, Glyzyl-Glyzin, Natriumsulfat, Au- und Ag-Präparate, Pernämyl und Vitamin A erwiesen sich dabei als wirkungslos. Auch in diesem Falle wirkte die Blockade des Retikulo-Endothels als erfolgswidrig. J. Dieckhoff und Laurentius (610) bestätigten, daß die Ascorbinsäure das Leben der diphtherievergifteten Kaninchen verlängern, nicht aber retten kann. Die Tiere gehen an schweren Parenchymschädigungen zugrunde. Cortin allein ist wirkungslos. Ascor- binsäure + Cortin, wenn rechtzeitig (spätestens acht Stunden nach der Vergiftung) angewandt, können noch das Leben der Tiere retten; späteres Einsetzen der Therapie kann den Tod der Tiere nur aufhalten. Bei Diphtherie-, sowie bei Ruhr-Intoxika- tionen der Katzen (J. Dieckhoff (568)) kommt es genau so wie bei nebennierenlosen Tieren und Addisonkranken zu: Blutdrucksturz, Verkleinerung der zirkulierenden Blutmenge und einer Bluteindickung, sowie zu der Erhöhung der Empfindlichkeit ihrer Blutdruckregulation gegenüber dem Histamin. Auch diese Veränderungen bleiben viel weniger ausgeprägt, wenn spätestens 8—10 Stunden nach der Vergiftung die Tiere 85 mit Percorten behandelt wurden. Erhalten die Tiere Percorten erst 24—48 Stunden nach der Intoxikation, so kommt es zu denselben schweren Störungen des Blutdrucks und der zirkulierenden Blutmenge, wie bei den unbehandelten Tieren. Die Ascorbinsäure + Cortin-Behandlung kann auch die durch die Veränderung der Kapillarenpermeabilität bedingten Störungen im Elektrolyt- und Gasstoffwechsel im Blut und Gewebe günstig beeinflussen, wenn sie rechtzeitig (8—10 Stunden nach der Vergiftung) begonnen wird (J. Dieckhoff und Schulze (604)). Interessant ist in diesem Zusammenhang, daß die Injektion von thyreotropem Hormon der Vorderhypophyse eine ähnliche Wirksamkeit wie die Ascorbinsäure + Cortin-Therapie bei der experi- mentellen Diphtherievergiftung besitzt. Auf diese innersekretorischen Wechselbeziehun- gen wollen wir später eingehen. Auch Herbrandt (627, 628) beobachtete bei Katzen und Meerschweinchen eine lebensrettende Wirkung von Pancortex bei der Diphtherievergiftung. Ascorbinsäure allein war in kleinen Dosen unwirksam; in größeren könnte sie die Hämorrhagien in den Nebennieren teilweise hintanhalten. Die Wirkung von Nebennierenrindenpräpa- raten auf die Nebennierenblutungen ist nach Herbrandt so deutlich, daß man sie als Grundlage für eine biologische Auswertung der Cortinpräparate anwenden könnte. Schultz und Hecht (464) glauben, daß die Ascorbinsäure, wenn sie auch das Leben der diphtherievergifteten Tiere verlängern kann, trotzdem aber nicht imstande ist die in den parenchymatösen Organen schon vorgekommenen Schäden rückgängig zu machen. Sie schließen daraus, daß die Ascorbinsäure nur auf das im Blut kreisende, nicht aber auf das im Gewebe schon verankerte Diphtherietoxin entgiftend wirken kann. Bei diphtherievergifteten Meerschweinchen kommt es zu deutlichen Schädigun- gen der Odontoblasten und des Dentins. Bei täglicher Zufuhr von 0,8 mg Ascorbin- säure sind diese Erscheinungen schwächer entwickelt; bei 5 mg fehlen sie gänzlich (C. King, R. Musulin und W. Swanson (633). Auch auf die durch das Toxin beim Tier hervorgerufenen Stöi'ungen in Anzahl und Aussehen der Blutzellen (besonders Ery- throzyten) wirkt die Ascorbinsäure verbessernd (A. Sigal (664)). Weiterhin wurde die therapeutische Wirksamkeit von ausreichenden Dosen an Ascorbinsäure und Cortin im Tierversuch von H. Schmidt (661), A. Ebel u. H. Mautner (613), sowie von A. C. Yen, T. J. Kurotchkin und H. C. Chang (688) nachgewiesen. A. Aicham und H. Bock (590) sahen bei der Behandlung von experimenteller Con- junctiva-Diphtherie, sowie der kutanen Reaktion auf die Toxininjektion beim Tier gute Erfolge mit Ascorbinsäure + Cortin. B. Vasile (680) hat keine lebensrettende Wirkung von Ascorbinsäure allein bei der Diphtherieintoxikation der Tiere gesehen. Der Tod der Tiere war nur wahrscheinlich infolge der durch Ascorbinsäure bedingten Kapillarenabdichtung und der dadurch ver- zögerten Toxinresorption aus dem Unterhautzellgewebe um ca. 24 Stunden ver- schoben. W. Scott u. a. (663), sowie H. Hoffmann-Wülfing (630) konnten mit den Nebennierenrindenpräparaten weder das Auftreten der Hautreaktionen bei suble- talen, noch das Sterben der Tiere bei letalen Diphtherietoxindosen verhindern. Unter Einhaltung gewisser Bedingungen gelang dies aber mit Sympathol, wobei an die even- tuelle toxinzersetzende Wirkung des Symphatols gedacht wurde. Überblickt man diese zahlreichen und mannigfaltigen Literaturzitate über die Frage der Beeinflussung der experimentellen Diphtherievergiftung durch Ascorbin- säure und Cortin, so kommt man zu dem allgemeinen Schluß, daß diesen beiden Kör- pern dabei zweifellos eine bedeutende Rolle zukommen muß. In einem gewissen Miß- verhältnis dazu stehen die negativen Resultate der neueren Versuche der Ascorbin- säure + Cortin-Therapie bei der Menschendiphtherie. Man muß dabei aber berück- sichtigen, wie es besonders klar die Untersuchungen von Dieckhoff (607—609) gezeigt haben, daß die Behandlung von diphtherotoxischen Störungen beim Tier nur dann Aussicht auf Erfolg hat, wenn sie sehr frühzeitig — bis spätestens zehn Stunden nach 86 der Vergiftung — eintritt. Wahrscheinlich bewirkt das Diphtherietoxin in dieser Frist schon solche Veränderungen (wahrscheinlich in erster Linie an den Gefäßwänden), daß sie durch eine nachträgliche Ascorbinsäure + Cortin-Therapie nicht mehr rück- gängig gemacht werden können. Beim Menschen wird das Diphtherietoxin nicht auf einmal einverleibt, sondern wahrscheinlich erfolgt sein Übertritt in die Blutbahn kontinuierlich oder wenigstens in mehreren Schüben. Außerdem ist uns der Zeitpunkt des Einsetzens der Toxämie un- bekannt, so daß die Ascorbinsäure -f Cortin-Therapie fast immer zu spät kommt, wenn die durch Toxin angerichteten Schäden nicht mehr reversibel sind. Es kann da- her von einer weiteren Ascorbinsäure + Cortin-Behandlung höchstens erwartet wer- den, daß sie die späteren Beschädigungen hintanhalten kann. Ob sie die schon be- stehenden Schäden reparieren kann, ist mehr als fraglich. Die Ascorbinsäure wirkt dabei in erster Linie als ein Redoxkörper. Dafür sprechen schon die oben zitierten Befunde von Lotze und Thaddea über die lebensrettende Wir- kung solcher Redoxkörper wie des Zysteins und Glutathions. Besonders die Rolle dieses letzten — des Glutathions — wurde von P. Locatelli in einer Reihe von Ar- beiten eingehend untersucht. Sie fand zuerst (639), daß das Diphtherietoxin, ähnlich wie bei der Ascorbinsäure, auch beim Glutathion seine Dehydrierung an der Luft in vitro beschleunigen kann. Die Reaktion: 2 Glut.-SH = Glut-S-S-Glut. wird in Richtung der Bildung der oxy- dierten Disulfidform bevorzugt gefördert. Außerdem wird ein Teil des reduzierten Glutathions irreversibel zerstört. Dieser Verlust an Glutathion beträgt 30—50 °/o seines Anfangswerts. Er konnte mit toxinfreier Bouillon oder Peptonlösung nur im neutralen oder alkalischen Medium bewirkt werden. In saurem Milieu waren nur die toxin- haltigen Nährböden zur Glutathionzerstörung befähigt. Eine übermäßige Alkalisierung oder Säuerung des Milieus führt zu einer spontanen irreversiblen Zerstörung des Glutathions. Die beiden Reaktionen, die reversible und die irreversible, können durch die glei- chen Faktoren beeinflußt werden. So werden sie durch Sauerstoffdurchleitung be- schleunigt, durch KCN oder im Vakuum gehemmt (640). In vivo fand Locatelli (641), daß 30—60 Minuten nach Einspritzung einer massiven, in 4—6 Stunden die Tiere tötenden Toxindosis eine bedeutende Abnahme des redu- zierten, sowie des gesamten Glutathions im Blut eintrat. Nach dieser anfänglichen Ab- nahme kommt es beim Kaninchen und beim Hund zu einer Blutgluthation Vermehrung, die auch über den Anfangswert vor der Vergiftung ansteigen kann. Da es im Ge- webe dabei zu keiner Glutathionabnahme kommt, kann man diese spätere Glutathion- ämie nicht mit einer Ausschwemmung des Glutathions aus dem Gewebe erklären (642). Sie ist teilweise durch Zunahme der relativen Menge von glutathionreichen Erythrozyten im eingedickten Blut, zum Teil auch möglicherweise durch Glutathionsynthese im Blut selbst bedingt. Es ist auch möglich, daß das zuerst in Anwesenheit von Toxin de- hydrierte Glutathion im Blut später durch irgendwelche Hydrierungsmechanismen in reduzierte Form wieder übergeführt bzw. regeneriert wird (643). Nach der Diphtherieintoxikation des Meerschweinchens kommt es außer der schon früher mehrfach erwähnten Abnahme der Ascorbinsäure in Nebennieren auch zu einer, wenn auch viel geringeren und später auftretenden Verminderung ihres Glutathions (644). Wenn aber das Diphtherietoxin vor der Einspritzung mit einer Lösung von reduziertem Glutathion vermischt wurde, überlebten die Tiere die Ver- giftung, und bei ihnen traten keine Veränderungen im Ascorbinsäure- und Glutathion- gehalt ihrer Nebennieren auf. Durch eine Vorbehandlung mit 10% Natriumthiosulfatlösung (intravenös) konnte K. T. Gluchow (621) beim Kaninchen eine lebensrettende Wirkung bis gegen 4 Dlm des Diphtherietoxins erzielen. Nachträgliche Thiosulfatbehandlung blieb wirkungslos. 87 5. Wirkung auf die übrigen endokrinen Drüsen Es ist ohne weiteres klar, daß solche weitgehenden Veränderungen in den Neben- nieren nicht die alleinigen im endokrinen System sind. Nach J. Dieckhoff (604) treten am vierten Intoxikationstage im Hypophysenvorder- lappen gewisse histologisch nachweisbare Veränderungen auf (Abnahme der chromo- phylen Bestandteile, Auftreten von großen, blassen „Erschöpfungszellen“, Karyopyk- nose, interstitielles ödem), die von dem Ausmaß der Zerstörung der Nebennieren- rinde durch das Diphtherietoxin abhängig sind. Sie lassen sich durch frühzeitige As- corbinsäure + Cortin-Behandlung in ihrem Entstehen verhindern. G. Schallock (702) aber konnte in dem Hypophysenvorderlappen bei 51 an perakuter Diphtherie verstor- benen Kinder keine organische Veränderungen feststellen. Durch Abschwächung der Hypophysentätigkeit soll es nach Dieckhoff zu einer Verminderung der Bildung von thyreotropem Hypophysenhormon, sowie zu einer Ab- schwächung der Schilddrüsentätigkeit kommen. Nach der Zufuhr von thyreotropem Hormon wird die Schilddrüse wieder aktiv. Auch die Ascorbinsäure +- Cortin-Therapie führt unter Vermittlung der Hypophyse zum Aufrechterhalten der normalen Tätigkeit der Tyreoidea bei einer Diphtherieintoxikation. Wiethold (705) konnte im Mittellappen der Hypophysen von diphtherieinfizierten Meerschweinchen und Kaninchen keine pethologischen Veränderungen feststellen. Auch P. Locatelli (698) bestätigt, daß eine Dosis von Diphtherietoxin, die das Meer- schweinchen in 48—72 Stunden tötet, nicht nur zu einer Zunahme des Gewichts der Nebennieren, sondern auch zu einer Vermehrung des Gewichts der Schilddrüse führt, während das Gewicht der Hypophyse dabei abnimmt. Die Thyreoideavergröße- rung entspricht der Größenordnung nach derjenigen, die der Menge von thyreotropem Hormon entspricht, die in 200 mg getrockneter Vorderhypophyse enthalten sind. Locatelli beobachtete auch, daß Tiere, bei denen die Schilddrüse durch Zufuhr von thyreotropem Hormon oder Thyroxin in einem hyperthyreotischen Zustand versetzt ist, viel rascher als die normalen Tiere an Diphtherievergiftung verenden. Nach A. P. Andrejewa-Kostygowa (691) ruft das Diphtherietoxin noch in einer Verdünnung 1 : 10.000 eine Verengung der Blutgefäße in der isolierten Schilddrüse des Hundes hervor, die ihr Maximum etwa nach zwei Stunden erreicht. Diese Erscheinung wird zur Erklärung des plötzlichen Todes nach unbedeutenderen Bewegungen von Diphtheriekranken, sowie des niedrigen Fiebers bei diesen Patienten herangezogen. Weiterhin sah Locatelli, daß es bei den mit teilweise durch Glutathion entgiftetem Diphtherietoxin gespritzten Meerschweinchen, die nicht zugrundegingen, in 20—30 Tagen zu einer bedeutenden Vergrößerung des Maßes und Gewichts ihrer Nebennieren kommt (699). Auf Grund des histologischen Aussehens dieser hypertrophierten Neben- nieren, ihres vermehrten Cholesteringehalts, sowie anderer Überlegungen, kommt Locatelli zu dem Schluß, daß alle diese Veränderungen nicht durch direkte Toxinein- wirkung auf die Nebennieren, sondern indirekt durch die Beeinflussung der Thyre- oideatätigkeit hervorgerufen werden. Es scheint nach diesen bisherigen Forschungsergebnissen, daß bei der Diphtherie- intoxikation ein gewisses Wechselspiel zwischen diesen drei endokrinen Drüsen be- steht. Anfänglich beeinflußt das Diphtherietoxin die Nebennieren; ihre Beschädigung führt zur Inhibition der Bildung des thyreotropen Hormons in der Hypophyse und da- durch zur Verminderung der Schilddrüsenaktivität. Länger andauernde Störung dieser letzten Funktion führt ihrerseits zur Hypertrophie der Nebennieren, womit der endo- krine Zyklus gewissermaßen geschlossen wird. Am Pancreas hat D. Combiesco (694) bei dem diphtherievergifteten Ziesel (Citellus citellus) schwere hämorrhagische Entzündung beobachtet. Blutungen kommen in den 88 Wänden der Arteriolen vor. Wahrscheinlich ist das nebenliegende Parenchym auch in Mitleidenschaft gezogen. Dadurch kann es zu späterem Versagen des Pancreas kommen. Ähnliche hämorrhagische und nekrotische Veränderungen wurden auch in den Langer- hansschen Inseln beschrieben (D. Combiescu und V. lonescu-Botez (695)). Bei den an Diphtherie verstorbenen Kindern sieht man auch Hämorrhagien im Pancreas, die aber schwächer als beim Ziesel sind. Im Thymus von den an Diphtherie verstorbenen Kindern ist der retikuläre Apparat, besonders die Mastzellen, vergrößert (Argaud und Pesque (692)). In Epithelkörperchen tritt beim Hunde nach einer Diphtherie-Intoxikation eine starke Hyperämie mit Blutergüssen, hydropischer Degeneration und Zellnekrose ein. Klinisch fällt die Temperatur nach einer 3—4tägigen Erhöhung bis auf 33 0 ab, das Gewicht fällt, es stellt sich eine Apathie mit spastischen Paresen und klonischen Krämpfen der gesamten Körpermuskulatur und einer erhöhten Kalkausscheidung im Urin ein — alles Zeichen einer Epithelkörperchen-Insuffizienz (Bojew (693)). In der Leber sieht man zuweilen bei toxischer Diphtherie pathologische Verände- rungen. Nach G. Schellhorn (704) kommen in 21—23 % der Fälle — trübe Schwellung des Parenchyms, in 2 °/o Zeichen der Degeneration vor (bei den innerhalb der ersten 5—10 Diphtherietage verstorbenen Kindern). Lotze und Thaddea (646) haben in der Leber bei Diphtherievergiftung- Oedeme, Blutungen, diffuse oder circumscripte Läpp- chenverfettung gesehen. H. Gohr und W. Bolt (571) schließen auf Grund ihrer Labora- toriumsbefunde am Blute der Diphtheriekranken, daß bei ihnen kein Anhalt für das Vorliegen einer schweren irreparablen Leberschädigung durch das Diptherietoxin be- steht. Dieses Organ ist jedenfalls viel weniger als z. B. Herz oder Nebennieren bei Diphtherie beschädigt. G, Scheff und E. Horner (703) sahen in der Leber von diph- therievergifteten Tieren eine bedeutende Abnahme des Fetts, R. A. Crespi (696), die des Glutathions. Am Hoden ruft das Diphtherietoxin bei Ratten, in subletalen Dosen angewandt, gewisse Schädigungen des Epithels, der Spermiogenese und der Hormonproduktion hervor (C. A. Pfeiffer (701)). An den normalen Spermatozoon selbst löst es keine spezifische Reaktion aus (L, Donaldson und A. Vorwald (697)). Das Follikelhormon hat bei weiblichen, das männliche Keimdrüsenhormon bei männlichen Meerschweinchen eine Schutz Wirkung gegenüber dem Diphtherietoxin ausgeübt, die wahrscheinlich auf einer Erhöhung der allgemeinen Widerstandskraft der Tiere beruht (M. Magara (700)). 6. Wirkung anderer Vitamine als C Nach den Beobachtungen von C. Torrance (716) sind die mit Vitamin A gefütterten Meerschweinchen nicht resistenter gegenüber Diphtherieintoxikation als die Kontroll- iere. Bei Verfütterung auch größerer Mengen von Vitamin A kommt es nicht zu einer Aufspeicherung in der Leber, ausgenommen wenn die frühere Ernährung der Tiere kein Vitamin A enthielt. Auch J. Chalier und M. Jeune (708) konnten keine schützende Wirkung der Vitamin A-Verfütterung bei einer Dinhtherieintoxikation der Tiere beobachten. Trotzdem besteht eine Parallelität zwischer der Überlebensdauer der diphtherieinflzierten Tiere und dem Gehalt ihrer Leber an Vitamin A (C. Torrance). B. A. Peters und R. N. Cunningham (712) konnten eine gewisse klinische Ähnlich- keit zwischen dem Spätstadium einer toxischen Diphtherie und der Beri-beri fest- stellen. Trotzdem wurde weder im Tierversuch noch bei diphtheriekranken Menschen eine Wirkung des Diphtherietoxins auf den Anenrinstoffwechsel (Vitamin Bi) — ge- messen am Gehalt der Brenztraubensäure im Blut — nachgewiesen. Therapeutisch 89 gelang es L. Frey (710) mit großen Dosen von Aneurin nur die vagusbedingten Er- scheinungen der Zwerchfellähmung zu mildern. Wirkung auf andere postdiphtherische Lähmungen wurden nicht eindeutig nachgewiesen. Nach H. Reinhard u. K. Schwartzer (713) war der Gehalt des Aneurins im Harn bei 17 Diphtheriekranken vermindert. Bei nicht komplizierten Fällen kehrt er in der Rekonvaleszenz wieder zur Norm zurück. Beim Auftreten der Lähmungen sinkt er wieder ab. Trotzdem ist eine deutliche Besse- rung der Lähmung nach der Aneurinbehandlung nicht zu sehen. F. Tecilazic (715) berichtet über die gute prophylaktische Wirkung der frühzeitigen längeren Aneurintherapie und das Auftreten von Spätlähmungen bei Diphtherie. Die Lähmungen selbst konnte er nicht mit Aneurin ausheilen. Dagegen sah E. Schröter (714) mit dem Aneurin (Betaxin) bei Diphtherielähmungen gute Heilerfolge. G. E. Donnovan und M. Bannister (709) konnten allerdings nicht die Diphtherielähmungen und -Kreislaufstörungen, wohl aber die Störungen des Appetits und des allgemeinen Befindens bei Diphtherie beeinflussen. Nikotinsäure übt keine Schutzwirkung auf die Diphtherietoxikation beim Meer- schweinchen aus (L. Perosa und P. de Vita (711)). Vitamin E bietet nach den Befunden von U. Butturini (607, 707) einen Schutz gegen die degenerativen Schädigungen von Nebennieren, Myocard, Skelettmuskeln, Leber und peripheren Nerven beim diphtherievergifteten Tier. Es hat auch eine gute Wir- kung auf die postdiphtherischen Paresen beim Menschen. Seine optimale Dosis ist 3 mg pro Tag per os. 7. Wirkung auf die Nieren, Stickstoffwechsel, Blutdruck An den Nieren von diphtherievergifteten Kaninchen beobachtete G. Parassi (724) folgende pathologische Veränderungen: a) beim akuten Diphtherietode (in 2—3 Tagen); Blutungen aus den Glomerulus- gefäßen und peritubulären Kapillaren; Nekrosen; perivaskuläre Infiltrate aus Poly- nuklearen; b) beim subchronischen Tode (3—15 Tage): Veränderungen degenerativer Natur am Glomerulusendothel; Thrombosierung der Gefäße; Anfang der fibrozytären Pro- liferation; c) bei den überlebenden Tieren (20—95 Tage nach der Intoxikation) diffuse Binde- gewebswucherung in den Glomeruli; arrophische Veränderungen der von ihnen ab- gehenden Tubuli und Vermehrung des bindegewebigen Interstitiums. Alles in allem — ein toxisches umschriebenes Glomerulonephritis. Dagegen betrachtet Randerarth (725) die bei Diphtherie des Menschen vorkommen- den Nierenschädigungen als von vorwiegend nephrotischer Natur. Im Harn gibt es viel Eiweiß, kein Blut; viele Zylinder, spärliche Leukozyten im Sediment. Patho- logische Veränderungen an den Nieren im Sinne einer Glomerulonephritis wurden nicht gesehen. Wenn Blut im Harn doch festgestellt wurde, handelte es sich nicht um eine Nierenentzündung, sondern um eine toxische Kapillarenschädigung. Auch H. Stiepel (726) sah bei 15 an Diphtherie verstorbenen Kindern in den Nieren nur nephrotische Veränderungen; bei acht davon wurden auch Nierenhämorrhagien ge- sehen, die auf eine toxische Gefäßwandschädigung in den Glomerulusschlingen zurück- zuführen sind. Auch H. Brugsch und G. Fülling (717), die eine Übersicht der älteren Literatur über die Nierenschädigungen bei Diphtherie gegeben haben, heben einen ähnlichen Harn- befund, wie Randerarth, hervor. Weder im Sediment noch im Eiweißgehalt des Harns 90 ist eine Parallelität zu der Krankheitsschwere zu finden. Bei stark verändertem Sedi- ment fehlen Ödeme und Blutdrucksteigerung. Der erhöhte und weiter ansteigende Rest-N im Blut wird als prognostisch schlechtes Zeichen bewertet. Die Azotämie, die bis zu 90 mg % Rest-N ansteigen kann, wird aber nicht mit einer Nierenschädigung, sondern mit den Veränderungen in Nebennieren und Leber in Zusammenhang ge- bracht. Uber Albuminurie bei Diphtherie siehe auch bei O. Künzel (723). Die Azotämie kommt bei Diphtherieintoxikation schon sehr frühzeitig (nach 6—9 Stunden) und regelmäßig vor (J. Chalier u. a. (719, 720)). Sie ist von der angewandten Toxindosis abhängig und ist bei hungernden Tieren viel schwächer entwickelt. Diese Rest-N-Erhöhung entsteht nach J. Dieckhoff beim Tier auf Kosten des Residual-N; der Harnstoff-N ist relativ vermindert. Die Harnstoffsynthese in der isolierten Leber ist dabei gestört. Der Zusatz von Ascorbinsäure 4- Cortin zur Perfusionsflüssigkeit stellt diese Aktivität der Leber nicht wieder her. Dagegen bewirkt die frühzeitige Ascorbin- säure + Cortin-Behandlung der diphtherievergifteten Tiere die Normalisierung ihres Blut Rest-N. Beim Menschen wurde die Erhöhung des Blut-Rest-N besonders des Harnstoff-N von Deussing (721) bei Diphtherie beobachtet. Während K. H. Höffker (722) zwischen der Höhe des Rest-N im Blut und der Krankheitsschwere keinen Zusammenhang findet, bewerten Bennhodt-Thomsen und Dieckhoff (606) dieses Symptom als prog- nostisch schlechtes Zeichen, besonders wenn der Rest-N im Blut im Laufe der Er- krankung ansteigt. Nach den älteren Befunden von Romberg, Pässler u. a. kommt es bei Diphtherie- intoxikation beim intakten Herz zu einem Blutdrucksturz, der durch Aortaabklem- mung und NaCl-Infusionen verhindert werden kann. Bei 215 über sieben Jahre alten Kindern sah W. Catel (718) in 15 °/o der Fälle eine mehr oder weniger lange dauernde Blutdruckerhöhung bis zu 10—90 % über die Norm. Eine Nephritis war auch in der Anamnese nicht vorhanden. Die Ursache dieser Hypertonie wird deshalb in einer funktionellen oder anatomischen Störung der Nierendurchblutung, besonders in den Glomeruli und in den kleineren Vasa afferentia, gesucht. Dagegen erklärt R. Voß (729) die in fünf Fällen beobachtete postdiphtherische Hypertonie durch funktionelle Schädigung des Vasomotorenzentrums. Endlich sei noch in diesem Zusammenhänge einer in der neuesten Zeit erschienenen Arbeit von F. Vacirca (727, 728) gedacht. Er fand, daß die formolisierten Diphtherie- kulturfiltrate (Formoltoxoide) im Tierversuch die Nieren vor der schädlichen Wirkung der Uransalze schützen können. Sie erhöhen die Uranausscheidung im Harn bei gleich- zeitiger Verminderung der Diurese. Die wirksame Substanz wird „Fattore V“ genannt. Sie wird nicht in den Keimen selbst, sondern im Nährboden auf Kosten einer seiner Bestandteile gebildet. Es handelt sich wahrscheinlich um ein Protein, bei dem die Be- setzung seiner Aminogruppen mit Formol eine besondere Rolle spielen muß. 8. Wirkung auf den Kohlehydratstoffwechsel Störungen der einzelnen im Kohlehydratstoffwechsel beteiligten Mechanismen und Faktoren wurden bei der Diphtherievergiftung schon seit längerer Zeit beobachtet. Noch F. Rosenthal (751) fand, daß bei den Kaninchen, die mit einigen Dlm des Diph- therietoxins vergiftet wurden, der Tod in 24—36 Stunden unter hypoglykämischen Erscheinungen eintrat. Nach A. Elkeles u. a. (739) zeigen die an toxischer Diphtherie Erkrankten gewisse Zeichen der Hypoglykämie auf: Adynamie, Kreislauf schwäche, motorische Unruhe, relativ geringes Fieber. Andererseits wurden aber von denselben, sowie von einigen anderen Autoren bei den toxischen Diphtheriefällen ganz normale, 91 manchmal sogar erhöhte, manchmal aber erniedrigte Nüchternwerte des Blutzuckers gefunden. Nach den Belastungsproben mit einigen Zuckerarten beobachteten sie dabei eine Verschlechterung der Zuckerverwertbarkeit und zwar in der Reihenfolge: Glu- kose, Galatose, Fruktose. Diese schlechte Zuckerverwertbarkeit ließ sich nicht durch Insulin verbessern (siehe auch G. Boccuzzi und R. de Mattia (732)). Da das Insulin, den Mäusen in einer Mischung mit Diphtherietoxin eingespritzt, gar keine Veränderungen in seiner Wirk- samkeit zeigt, vermutet man, daß das Diphtherietoxin nicht zu einer Insulinzerstörung, sondern zu einer Erhöhung der Insulinoresistenz des Organismus führen muß. Die letzte Vermutung wurde von Lawrence und Buckley (745), sowie von P. Ritterskamp und von R. Netzley (749) an diphtherievergifteten Kaninchen bestätigt. P. Bamberger, H. E. Never und H. Oelkers (593) haben dagegen auf Grund ihrer Belastungsversuche mit Galaktose und Fruktose geschlossen, daß bei Diphtherie- kranken die Verwertung dieser Zucker nicht nennenswert gestört ist. Die Herabsetzung der Glukoseverwertung bei Diphtherie wurde aber noch von F. J. Hector (743), A. Brems (734) u. a. festgestellt. F. Addari und F. Gottdenker (730) sahen bei der Ver- giftung von Meerschweinchen mit 1 Dlm des Diphtherietoxins: a) Hypoglykämie und b) eine verstärkte und verzögerte Blutzuckerkurve nach Glukosebelastung; Adrenalin und Ascorbinsäure können diese Erscheinungen abschwächen. Insulin wirkt sehr stark im Sinne einer Blutzuckersenkung. Daß die bei Diphtherietoxikation auftretenden Blutzuckerstörungen unter dem Ein- fluß der Nebennieren und Nn. splanchnici stehen, hat Mikami (747) nachgewiesen. Er beobachtete bei den mit subletalen Toxindosen vergifteten Kaninchen eine Hyper- glykämie und Glykosurie, die nach Durchschneidung von Nn. splanchnici ausblieben. Auch Elkeles (1. c.) konnte die Belastungshyperglykämie durch 0,5—1,0 ccm Ergotamin- tartrats (Gynergens) unterdrücken. Ob das Toxin direkt die Sympathicusendungen reizt oder dies erst durch eine vermehrte Adrenalinausschüttung aus den Nebennieren be- wirkt wird, blieb unentschieden. Im terminalen Stadium kommt es infolge der „Er- schöpfung“ beider Systeme (Sympathicus und Nebennieren) zur Hypoglykämie und Adynamie. Diese Auffassung über die Rolle des Adrenalins bei der diphtherotoxischen Hyperglykämie erhält nach Elkeles noch eine Unterstützung im häufigen gleichzeitigen Fehlen der Zuckerausscheidung im Urin. Ist doch nach Pollak (zit. nach Elkeles) bei den protrahierten Hyperadrenalinämien das Vorkommen von hyperglykämischen Zu- ständen ohne Glykosurie oft zu beobachten. Die von P. Bamberger u. a. (593) bei den mit Diphtherietoxin vergifteten Meer- schweinchen nachgewiesene Hyperglykämie war mit Ascorbinsäure + Cortin-Therapie nicht zu beeinflussen. Dagegen beobachteten C. de Marchi und E. Roncallo (746), daß man mit Ascorbinsäure + Cortin bei der Diphtherieintoxikation gute therapeutische Erfolge auch bei den dann vorkommenden Kohlehydratstoffwechselstörungen erzielen kann. Außer den Störungen im Blutzuckerspiegel und in den Zuckerbelastungskurven, kommt es im Verlauf der Diphtherieintoxikation auch zur Ausbildung anderer Ano- malien im Kohlehydratstoffwechsel. Der Grundumsatz ist nach W. Bolt (733) nach einem Latenzstadium von 8—10 Tagen vermindert. Diese Grundumsatzsenkung ist desto stärker, je schwächer die Intoxi- kation ist. Sie dauert meist bis zum Ablauf der dritten Krankheitswoch© an und kehrt dann zur Norm zurück. Ihre Ursache soll in einer toxischen Schädigung des endokrinen Apparats liegen. Der Gehalt des Bluts an organischen Säuren ist besonders am Anfang der Diph- therieerkrankung stark erhöht (E. Wladimirowa (753)). Die Erhöhung steht in einem gewissen Zusammenhang mit der Krankheitsschwere. 92 C. R. Dawson und E. Holmes (738) injizierten djen hungernden Kaninchen langsam eine Lösung des Na-lactats in die Vene. Es kommt danach zu einer kurzdauernden Hyperglykämie und Hyperlactacidämie, die in drei Stunden abklingen. Gleichzeitig kommt es zu einer Glykogenspeicherung in der Leber. Wurde dfis Lactat den Kanin- chen eingespritzt, die sich in einem frühen Stadium der Diphtherieintoxikation befan- den, so war die Erhöhung der Blutglukose und -milchsäure viel stärker und an- dauernder; die Leber speicherte kein Glykogen auf. Wenn den diphtherievergifteten Tieren zwei Stunden vor der Lactateinspritzung Cortin (Eucorton) gegeben wurde, verschwand die verabreichte Milchsäure sehr bald aus dem Blut, und die Leber füllte sich mit dem Glykogen auf. Die isolierten Leberschnitte von diphtherievergifteten Tieren können auch nur in viel geringerem Grade als die Schnitte von gesunden Tieren das Lactat aus der um- gebenden Lösung verwerten. Cortin hat keinen Einfluß auf diesen Vorgang. Auch im Harn ist in den ersten Tagen der Diphtherieerkrankung die Säureaus- scheidung vergrößert (J. Csapo (735)). Bemerkenswert ist an diesem Befund, daß bei den „toxischen“ Diphtheriefällen die Säureausscheidung im Harn nicht stärker als bei den „einfachen“ Diphtherieerkrankungen ist. In der Rekonvaleszenz verschwindet diese Erscheinung. Am vierten bis fünften Tage nach der Diphtherieintoxikation des Kaninchens kommt es auch zu einer vermehrten Diastaseausscheidung im Harn (W. Grunke und H. Lotze (740)). Ihr Höhepunkt wird am siebenten bis zehnten Tage erreicht (bis 512 Einheiten der Diastase nach Wohlgemuth); etwa am zwanzigsten Tage kommt sie zur Norm zurück. Von Wichtigkeit erscheint uns die Frage über die Beeinflussung des Glykogen- gehalts in den Muskeln (in erster Linie im Herzmuskel) durch das Diphtherietoxin. Diese Frage ist bisher von mehreren Autoren unterschiedlich beantwortet worden. W. Grunke u. a. (741, 742) sahen bei Meerschweinchen nach der Einspritzung von töd- lichen Dosen Diphtherietoxins keine Veränderungen im Myokardglykogen. Bei län- gerer Einwirkung subletaler Dosen kommt es aber zu einer Glykogenabnahme. Später fanden sie bei der Verwendung gewisser Verbesserungen in der Glykogendosierung (besonders schnelle Verarbeitung des Materials unter Einfrierung in der flüssigen Luft usw.) bei Ratten, daß das Glykogen im Herzmuskel zum Teil erheblich vermindert war. Manchmal aber sahen sie, daß auch in Anwesenheit von deutlichen mikroskopischen Myocarditiszeichen der Glykogengehalt im Herzmuskel normal war. Die Ascorbin- säure + Cortin-Behandlung konnte das verminderte Herzglykogen nicht wieder zur Norm bringen. P. v. Kiss und Kuicsar (744) beobachteten, daß bei vorgeschrittener Diphtheriever- giftung der Meerschweinchen der Gesamtgehalt ihres Herzmuskels an Kohlehydraten um ca. 36 °/o erhöht war. Da nach den Befunden von C. und G. Gori (736) im Muskel das Glykogen praktisch den Gesamtkohlehydraten gleichgesetzt werden kann, glauben v. Kiss und Kuicsar damit auch die Erhöhung des Herzglykogens bei Diphtherie nach- gewiesen zu haben. Auch P. Bamberger u. a. (1. c.), sowie H. Schumann (752) konnten eine Vermehrung des Herzglykogens nach einer Diphtherievergiftung bei Tieren feststellen. Das Gly- kogen in Skelettmuskeln und Leber zeigte keine eindeutigen Abweichungen von der Norm. Eine Störung der Phosphorylierung der Glukose im Muskelbrei konnte Schumann durch das Diphtherietoxin nicht erzielen. Er spricht den Kohlehydratstoff- wechselstörungen bei der Entstehung von Gewebsnekrosen bei Diphtherie keine be- sondere Bedeutung zu. Eine Abnahme des Glykogens nach Diphtherievergiftung glau- ben Ebel und Mautner (613) im Myokard histologisch, S. Thaddea (669) in den Muskeln chemisch nachgewiesen zu haben. 93 Bei jungen nüchternen Kaninchen im Frühstadium einer Diphtherieintoxikation sah B. Corkill (737), daß es nach Injektion von Insulin oder Insulin + Adrenalin zu keiner Glykogenablagerung in ihrer Leber kommt, die sonst bei gesunden Tieren regelmäßig danach auftritt. Nach dem Insulin kommt es bei vergifteten Tieren zu einer langsamen Blutzuckerabnahme, der aber nachher eine Steigerung folgt. Das letzte wird durch die verstärkte Adrenalinsekretion der Nebennieren bedingt. Das Ergotoxin hebt diese Insulinresistenz auf; die Störung der Glykogenablagerung in der Leber bleibt aber auch nach Ergotoxin bestehen. Es scheint, daß das Diphtherietoxin tatsächlich an sich keine größeren Veränderun- gen im Kohlehydratstoffwechsel hervorruft. Bei den perakut diphtherievergifteten Meerschweinchen konnten Bamberger u. a. (1. c.) keine Änderungen in der Atmungs- größe des Gesamttieres, sowie in der Atmung und anaeroben Glykolyse von Herz- muskel, Nieren, Leber und Nebennierenmark feststellen. Bei der Nebennierenrinde war die Atmung, sowie die anaerobe Glykolyse 2—3mal verstärkt. Diesen letzten Be- fund versuchten die Autoren mit der Hyperämie der Nebennierenrinde, besonders aber mit Veränderungen in ihrem Ascorbinsäuregehalt in Verbindung zu setzen. Nach J. Dieckhoff (609) ist dpr Sauerstoff verbrauch der isolierten Milz, Leber und Nebennierenrinde von diphtherievergifteten Tieren anfangs gesteigert. Andere Organe weisen keine Abweichungen im Sauerstoff verbrauch auf. Am vierten bis sechsten Krankheitstage atmen alle Organe deutlich schwächer als im gesunden Zustande. Am isolierten Hühnerherzmuskel konnten B. A. Peters und R. N. Cunningham (750) keine Wirkung des Diphtherietoxins auf seine Atmung, aerobe und anaerobe Gly- kolyse feststellen. Es wirkt ebenfalls nicht auf folgende Fermente: a) Succino-, Lactico-, Malico-, Oxybutiro-, Glyzerophosphat- und Pyruvico-De- hydrasen; b) Amino-, Aminosäuren- und Adrenalinoxydasen; c) eine Reihe von phosphorylierender Enzyme; d) Autooxydation des Adrenalins. Das Diphtherietoxin beschleunigt die Oxydation des .Lezithins in Anwesenheit von Glutathion. Nach Zubkowa und Kassil (754) erhöhen die starken Diphtherietoxindosen den Katalasegehalt in der Leber, Muskeln und Nebennieren von Meerschweinchen und Kaninchen. Es ist noch nicht geklärt, ob dabei die Katalasewirkung gefördert oder die der Antikatalase gehemmt wird. 9. Beteiligung der Schwermetalle T. Wohlfeil (757) berichtet: 1. Ferro- und Cupri-Verbindungen in großen Mengen prophylaktisch diphtherie- infizierten Meerschweinchen einverleibt, können lebensrettend wirken. Einmalige Gabe der Ferro-Salze vor oder nach dem Tage der Infektion soll deren Ablauf aber ver- schlimmern. Nachbehandlung nach erfolgter Infektion soll das Leben der Tiere ver- längern, ohne die Mehrzahl der Tiere vor dem Tode zu bewahren. 2. Dinatriumphosphat und Magnesiumsulfat prophylaktisch gegeben, beschleunigen den Diphtherietod der Tiere. Länger dauernde Phosphatvorbehandlung (ohne Mag- nesiumsulfat) führt aber nicht zur Krankheitsverschlimmerung. Phosphat allein wirkt, nach der Infektion gegeben, wieder infektionsverstärkend. 3. Eisen- bzw. Phosphatprophylaxe kann die Wirkung der Serotherapie unter- stützen. 94 Zur Erklärung dieser Befunde wurde die Hypothese aufgestellt, daß Mg- und PCh-Ionen die kohlehydratspaltenden Fermente der Diphtheriebakterien im infizierten Tierkörper aktivieren und dadurch ihre Virulenz steigern können. Schwermetalle sollen nach Wohlfeil als Hemmstoffe im Kohlehydratstoffwechsel der Diphtheriekeime wirksam sein. Andererseits unterstützen die Ferroverbindungen sowie die Phosphate nach T. Wohlfeil und H. Becker (758) die aktive Immunisierung von Meerschweinchen mit abgetöteten Diphtheriekulturen, sowie mit Präzipitatimpfstoffen. Ihre Wirkung soll von unspeziflscher Natur sein, und zwar soll Phosphat die antiinfekteriellen Abwehr- funktionen des Organismus fördern. H. O. Hettche (755) konnte keine schützende Wirkung der peroralen Darreichung von Fe, Cu- und Mn-Salzen auf die Diphtherieintoxikation beim Meerschweinchen nachweisen. Subkutan gegeben verlängerte Fe (sowie Fe + Cu + Mn) die Überlebens- zeit der vergifteten Tiere auf das 3—4fache. Bei den mit Fe-Salzen behandelten Tieren war der Fe-Gehalt in Leber und Milz 2—3mal vergrößert, nicht aber bei den Cu- und Mn-Tieren. Histochemisch konnte die Gegenwart von Fe nur in der Milz (und zwar besonders bei Cu- und Mn-Tieren) fest- gestellt werden. Es soll eine, wenn auch nur indirekte Beziehung zwischen der Über- lebenszeit der Tiere nach der Diphtherieintoxikation und dem Fe-Gehalt ihrer Milz bestehen. Hettche steht auf dem Standpunkt, daß alle drei Metalle (Fe, Cu und Mn) das Eisen aus seinen Depots im Organismus mobilisieren können (Reizeisen) und dadurch ihre antitoxische Fähigkeit bestätigen. Dabei ist nicht so sehr die absolute Fe-Menge, als seine Bindungsform von Bedeutung. Es handelt sich danach bei der Metallwirkung weder um eine Stimulierung der Antikörperbildung noch um eine Hemmung der Bak- terienfermente, noch um eine Aktivierung der Gewebsfermente. Diese Hypothese ist in der letzten Zeit durch Ergebnisse von K. H. Schäfer (756) ergänzt und bekräftigt worden. Er fand, daß bei der Maus das Verhältnis (Haemo- globin-Eisen) : (Körpergewicht) konstant ist. Dagegen ist der Quotient- (Gesamteisen der Gewebe) : (Körpergewicht) veränderlich und nimmt bei der Körpergewichtzunahme ab. Die Veränderung dieses Quotienten (bei gleichbleibendem Hämoglobingehalt des Blutes) kann unter gewissen Voraussetzungen als Maß für den Fe-Bedarf des Tieres angesehen werden. An Meerschweinchen und Mäusen wurde gefunden, daß bei der Diphtherieintoxi- kation das Eisen im gesamten Gewebe angereichert wird, und zwar in erster Linie in Milz, Leber, Knochenmark und Lungen, während die Nieren und übrigen inneren Organe weniger daran beteiligt sind. Für den Grad der Milz-Hämosyderose ist die Schwere der Intoxikation von Bedeutung: eine strenge Parallelität existiert aber nicht. Gleichzeitig kommt es zu einer Verminderung des Gesamtbluteisens. Diese Fe- Migration während einer Intoxikation oder Infektion wird als Ausdruck der ge- steigerten Tätigkeit des RES angesehen. Die Abnahme des Bluteisens (Locke, Maine und Rosbash (755a)) nach einer Injek- tion von Diphtherie- oder Tetanustoxin bei Pferden entspricht der bei den diphtherie-, Scharlach- und masernkranken Kindern beobachteten Erniedrigung des Serumeisens (Thoenes und Aschaffenburg (756a)). Dieselbe Plasmaveränderung, begleitet durch eine gleichzeitige Plasmakupfervermehrung, wurde auch von Heilmeyer, Keiderliag und Stuewe (754b), im Verlaufe der Diphtherieinfektion festgestellt; nach der Ent- fieberung kehren die Plasmaschwermetall-Werte zur Norm zurück. Es handelt sich dabei um „eine unspeziflsche und vorbereitende Reaktion des Organismus, welche der Antikörperbildung vorausgeht.“ Das während der Infektion intravenös injizierte Eisen (Ce-Ferro-Ferro-ascorbinat) verläßt die Blutbahn schneller als bei gesunden Personen. Es wird in außerordentlich 95 starkem Maße im Retikuloendothel, besonders in der Milz, abgelagert. Dieselben Ver- hältnisse wurden nicht nur nach der Diphtherie-Toxinvergiftung, sondern auch nach Einspritzung von artfremdem Eiweiß oder Tuberkelbazillen beim Kaninchen (Heil- meyer, Ehrich und Lange (754a)), sowie nach der Streptokokken- und Staphylo- kokken-Infektion oder Tetanusintoxikation weißer Mäuse (Schäfer (756)) gefunden. Nach Milzextirpation sammelt sich das Eisen vikariierend in den Nieren und anderen Teilen des RES an. Die Fe-Speicherung im Gewebe verläuft der Plasmaeisenverminderung parallel und scheint von dieser abhängig zu sein. Wenn nicht genügend Plasmaeisen zur Ver- fügung steht, werden die zum Haemoglobin-Aufbau dienenden Eisenmengen ver- braucht und im Retikulo-Endothel auf gespeichert; hypochrome Infektanämien sind als Folge solchen Geschehens zu betrachten. Nach Abheilen des Infektes wird das im RES angesammetle Eisen den hämatopoetischen Organen abgegeben. Der infizierte Organismus holt auch mehr Eisen aus der Nahrung entsprechend seinem erhöhten Eisenbedarf. Hettche (1. c.) konnte eine bedeutende Zunahme des histochemisch nachweisbaren Eisens in der Milz im Verlaufe einer Infektion nach weisen; dieses Eisen wird von ihm als diejenige Eraktion, die besonders aktiv in die Toxin- und Infektabwehr eingreift, betrachtet. Dieser unspezifische Toxinschutz erstreckt sich aber nur auf die frei im Blute kreisenden Toxine und Bakterien, nicht auf die im Gewebe verankerten. Es besteht wahrscheinlich ein gewisser Parallelismus zwischen der Abnahme des Titers des Serumeisens und der Blutascorbinsäure während des Infektgeschehens. Es wäre denkbar, daß dieser Ascorbinsäure-Mangel die physiologischerweise im Ge- webe stattfindende Reduktion des Gewebsferrieisens zur Ferroform hintanhält und auf diese Art zur Aufstapelung des aktiven Ferri-Schutzeisens im Retikuloendothel führt (Heilmeyer (754a)). 10. Wirkung auf den Herzmuskel Die pathologischen Veränderungen am Herzen hat L. Oheim (781) in der neueren Zeit an Leichen von 50 an Diphtherie Verstorbenen verfolgt, und dabei folgende Ver- änderungen festgestellt: Interstitielles ödem, wachsartige und fettige Degeneration des Myocards, Myolyse, Verkalkungen, leuko- und lymphozythäre Infiltrate, sowie die Wucherung der fixen Zellen in den durch den Gewebszerfall entstandenen Lücken. Auch Steffens sah an Herzen bei den an Diphtherie Verstorbenen Auflockerung und Quellung der Myofibrillen. Nach T. Brugsch (763) besteht die Herzschädigung in der ersten Diphtheriewoche in einer „serösen Entzündung“, an die sich in der zweiten Woche eine schwere De- generation des Myokards anschließt. In der dritten Woche kommt es zu einer Resorp- tion des zerfallenen Parenchyms und zur Ausbildung von Granulationen, die in der vierten Woche in eine Schwiele übergehen. Infolge der Gefäßschädigung kommt es auch zu den subendokardialen Blutungen. Besonders geschädigt ist das Reizleitungs- system. Ähnliche Veränderungen am Herzen werden auch von W. Grunke (768) ge- sehen, der sie für die auftretende Kreislaufschwäche in etwa einer Hälfte der Fälle verantwortlich macht. Clauberg und Döring (764) stellen fest, daß die histologischen Herzmuskel Verände- rungen bei den nach Diphtherievergiftung eingegangenen Meerschweinchen — im Gegensatz zu den Beobachtungen beim Menschen — auffallend gering waren, so daß der Spontantod dieser Tiere offenbar kein Herztod sein kann. In einem Viertel ihrer 96 Fälle vermochten letztgenannte Autoren überhaupt keinen pathologischen Herzbefund zu erheben; in einem weiteren Viertel fanden sie nur umschriebene, herdförmige Ver- fettungen. Vereinzelt waren einige kleine Fibroblastenwucherungen vorhanden. Frische Nekrosen konnten niemals nachgewiesen werden. Mit einer Ausnahme be- trafen die erwähnten Veränderungen ausschließlich die Muskulatur des linken Ven- trikels. M. Gukelberg (769, 770) hat die größten Myokardschädigungen bei den diph- therievergifteten Meerschweinchen in der Rundmuskelschicht, besonders früh an der Herzspitze, beobachtet. Diese Abschnitte des Herzens sind besonders schlecht mit Blut versorgt. Ihre Zellen enthalten wenig Indophenoloxydase, die im Laufe der Intoxi- kation noch abnimmt. Ascorbinsäure übte eine gewisse Schutzwirkung auf diese Oxydase, nicht aber auf das Überleben der Tiere aus. Was die pathologische Phyliologie des Herzens bei den diphtherievergifteten Tieren betrifft, beobachteten F. Addari und F. Gottdenker (730) am Hund, daß sein Herz bis zum Tode normal schlug, trotz des auf Null sinkenden arteriellen Blutdrucks. Nach seiner Isolierung arbeitete das Herz noch stundenlang. Das Elektrokardiogramm blieb normal. Beim Meerschweinchen bewirkt das Diphtherietoxin am isolierten Herzen, je nach dem Toxin-Verdünnungsgrad, bald eine abschwächende, bald eine verstär- kende Wirkung auf Myokard und Herzvagus aus (S. Sagara (785)). M. L. Reinhold (783) sah am Starlingschen Herzlungenpräparat beim Hund, daß nach Diphtherieintoxikation das Minutenvolumen abnimmt, Blutdruck im rechten Vor- hof absinkt; Stimulantia und Blutperfusion üben praktisch eine Wirkung auf das ver- giftete Herz aus. Nach A. F. Hecht (771) ruft das Diphtherietoxin beim Tiere keine interstitielle Myokarditis hervor. Ob an den postdiphtherischen Herz-Dauerschädigungen das Diph- therietoxin allein oder auch andere Ursachen schuld sind, ist noch unbekannt. Auf das isolierte Kaltblüterherz übt das Diphtherietoxin keine Wirkung aus (S. Roufgalis und J. Schröger (784)). Das Diphtherietoxin erhöht den Sauerstoffver- brauch des Myokards in vitro, besonders des rechten Vorhofs (Kaninchen) und ver- mindert ihn, wenn das den linken Vorhof betrifft (Michelazzi und Holz (777)). Eine besondere Erklärung der Pathogenese der diphtherietoxischen Herzschäden schlug A. Beer (759) vor. Die entzündlichen Herzveränderungen bei Diphtherie sollen unter der Einwirkung des im Blut kreisenden Toxins entstehen. Das Toxin wird im Myokard aus gewissen, noch nicht eindeutig geklärten Gründen, angereichert. Eine unmittelbare Wirkung des Toxins auf das Myokard sei unwahrscheinlich. Zwischen der ersten Berührung des Myokards mit dem Toxin und dem Auftreten von ersten Herzschäden liegt gewöhnlich ein latentes „Inkubationsstadium“. Das Bild der Diphtherietoxinwirkung auf das Herz entspricht nach Beer mehr einer allergi- schen Überempflndlichkeitsreaktion als der einer Vergiftung. Beer vermutet, daß das Toxin, gebunden an die Herzlipoide, eine Art von Antigen bildet, das das befallene Organ sensibilisiert und bei erneuter Toxinzufuhr zur Auslösung von lokal begrenzten Reaktionen am Herzen führt. Die Veränderungen am Herzen im Verlaufe einer Diphtherieinfektion beim Men- schen, sowie bei gelegentlich erst in der Rekonvaleszens auftretenden Spätschäden, besonders im Elektrokardiogramm, sowie die Elektrokardiogrammveränderungen beim Tier wurden in der letzten Zeit von vielen Autoren beschrieben, auf deren Bespre- chung wir im Rahmen unseres Berichts verzichten müssen. (F. Josephstal (772), G. W. Parade und U. Peterson (782), E. Kielhorn (773), H. Schuppler (786), P. v. Kiss (775), C. Koppel (776), A. Beer (760), K. W. Glauberg und H. Döring (764), A. Nadrai (779), L. Norpoth (780), E. Schwingel (787), W. Bolt und H. Rotkopf (762), E. W. Strauch (788), F. Kienle und M, Witzemann (774), R. Boiler (761) u. a.) 97 Erwähnt sei lediglich, daß nach den oben genannten Feststellungen von Clauberg und Döring am Meerschweinchen diesen Autoren zufolge — entgegen anders lauten- den Ansichten — die Elektrokardiographie kein geeignetes Verfahren zur Beurteilung der Diphtheriegiftwirkung bei diesen Versuchstieren sein kann. Die experimentelle Beeinflussung der Myokarddegeneration bei Diphtherieintoxika- tion des Meerschweinchens hat noch 1931 G. N. Myers (778) mit Erfolg mit Digitalis und Strophantin versucht. Dagegen konnten C. Edmunds und R. Smith (767) auch durch 13 Tage dauernde Vorbehandlung den Meerschweinchen mit 1U der tödlichen Dosis der Digitalistinktur keine Schutzwirkung auf ihr Herz erzielen. Nach einer Diphtherievergiftung steigt die Empfindlichkeit des Katzenherzens gegenüber dem Digitoxin und Quabain um 83 bzw. 64 °/o an (J. Dieckhoff und E. Schulze (765, 766)). Prophylaktische Digitalisierung • verschlechtert die Herzleistung des diphtherievergif- teten Herzlungenpräparates nach Starling. Strophantin wirkt darauf leistungsstei- gernd ein. Aber auch das Strophantin kann beim Meerschweinchen den Tod nur be- schleunigen (J. Ströder und S. Roufogallis (790)). 11. Wirkungen auf das Gehirn und die peripheren Nerven Das Gehirngewebe bindet in vitro von allen anderen untersuchten Geweben das Diphtherietoxin am meisten (H. Schmidt und Stockhusen (545)). Aber die Permea- bilität der Blut-Liquor-Schranke für das Diphtherietoxin ist sehr gering, so daß unter den gewöhnlichen Verhältnissen nur sehr wenig Toxin aus dem Blut in den Liquor und von da aus in das Hirngewebe eindringt. Deshalb ist es nicht verwunderlich, daß Tiere mit sehr toxinempflndlichen Organen (Nebennieren, Kreislauf) — z. B. Meerschwein- chen, Kaninchen eher zugrunde gehen, als bis sich im Blut genügend Toxin ansam- meln kann, um in nennenswerter Menge bis zum Gehirn vorzudringen. Bei anderen, weniger toxinempfindlichen Tieren (Mäuse, Ratten), die nicht so rasch an der Intoxi- kation eingehen, können sich im kreisenden Blut genügend große Mengen Toxin an- sammeln, um die Blut-Liquor-Schranke zu passieren. Deshalb sterben sie unter zere- bralen Erscheinungen. Der Mensch gehört in dieser Hinsicht der ersten Gruppe an. Eine ausführliche moderne Darstellung dieses sehr wichtigen Gebiets findet man im Buche von H. Schmidt — „Grundlagen der spezifischen Therapie“, Berlin, 1940, S. 493—504. Das Diphtherietoxin bindet sich sehr schnell an das Nervensystem (G. Ruelle (807)). Zu jener Zeit können die Körpersäfte noch kein Antitoxin enthalten. Auch die Zuführung des Antitoxins mit dem Heilserum kommt meist zu spät, weil die für die Nervenschädigung nötigen Toxinmengen zu dieser Zeit schon im Nervengewebe ver- ankert sind. Nach P. Massiere (798) kann das Diphtherietoxin außer dem Angriff auf die Gehirnzellen selbst, auch das Endothel der Gehirnarteriolen soweit schädigen, daß diese beschädigten Stellen thrombosiert werden. Als Folge dieser Thrombosen, sowie der von ihnen ausgehenden Embolien, kann es zur Bildung von Erweichungsherden Im Gehirn kommen, die das anatomische Substrat für eine Gruppe von zentral bedingten diphtherietoxischen Lähmungen bilden. W. Müller und G. Jakoby (800), sowie W. Müller (799) sahen an den Leichen der an . Diphtherie verstorbenen Kindern außer dem toxisch-gegenerativen und entzünd- lichen Gehirnveränderungen noch die Zeichen einer Hirnschwellung. Sie beschreiben ebenfalls eine histochemische nachweisbare Harnstoffanreicherung in dem Gehirn- gewebe. Sie wird als Folge einer extrarenal verursachten Harnstoffretention im Ge- webe angesehen. * 98 Histologisch fanden P. v. Kiss und P. Horanyi-Hechst (797) weder bei den an Diph- therie verstorbenen Kindern noch bei den diphtherievergifteten Meerschweinchen pathologische Veränderungen in den für die vegetativen Funktionen wichtigen Teilen des Zentralnervensystems (Hypothalamus, Pons, Medulla oblongata, sympathischen Grenzstrang, Seitenhörner des Rückenmarks). Besonders wird das Fehlen jeglicher mikroskopischer Schädigungen im Gebiet des Vasomotorenzentrums betont. In patho- physiologischen Versuchen konnten P. Bamberger und Never (731) mit dem Diph- therietoxin die Beweglichkeit der glatten Muskulatur im Meerschweinchendarm herabsetzen. Dagegen konnte H, Ekerfors (794) keinen Einfluß des Diphtherietoxins auf die Erregbarkeit des autonomen Nervensystems, sowie der glatten Muskulatur des isolierten Darms und Uterus beim Tier feststellen. Bei Kaninchen und Katzen ruft das Diphtherietoxin erst Erregung, dann aber Paralyse des sympathischen Nervensystems hervor (G. N. Myers (801)). Diese Wir- kung beginnt schon zu jener Zeit, zu der das Zentralnervensystem und der Para- sympathicus noch völlig intakt sind. Sie hat die Paralyse des gesamten neuro-vasku- lären Regulationsmechanismus zur Folge, und ist nicht durch die Abnahme des Adre- nalins der Nebennieren bedingt. Die wichtigsten beim Menschen vorkommenden diphtherietoxischen Störungen am Nervensystem sind die Früh- und Spätlähmungen. J. Glaser (795) beschreibt bei drei Fällen von postdiphtherischen Lähmungen deutliche degenerative und entzündliche Veränderungen an den Vorderhornzellen, des Rückenmarks und an den intraduralen Wurzeln. Zur Erklärung der Pathogenese der Spätlähmungen bei Diphtherie dps Men- schen erwägt H. Schmidt (1. c. S. 500) folgende Möglichkeiten: a) die verspätete Toxin- bildung von den in inneren Organen zurückgebliebenen Bakteriennestern, wenn das passiv zugeführte Antitoxin schon aus dem Organismus ausgeschieden ist; b) das an das Toxin gebundene Antitoxin könnte mit der Zeit aus dieser Bindung durch Abbau verschwinden und dadurch das nicht neutralisierte Diphtherietoxin wieder freimachen, das von den Nervenzellen abgefangen wird. Zugunsten dieser letzten Auffassung sprechen die von einigen Autoren (z. B. A. üoskocil (793)) mit Erfolg durchgeführten Versuche der nachträglichen Behandlung der Spätlähmungen mit Rinder- bzw. Schafheilserum. Die experimentellen Diphtherielähmungen wurden von G. Ramon (802—806) und seinen Mitarbeitern, sowie von Hosoya, Ozawa und Tanaka (796) an Hunden, Kanin - chen, Meerschweinchen, besonders aber an Hühnchen studiert. Durch Verwendung von unterneutralisiertem Toxin- und Antitoxin-Gemisch, sowie von nicht vollkommen neutralisiertem Formoltoxid wurde beim Tier eine Lähmung in 10 bis 25 Tagen, e nach der verwendeten Toxindosis erzielt. Ihre Ausdehnung ist ganz verschieden und kann sich bis zum Landryschen Symptomkomplex verstärken. Pathologisch-anatomisch sieht man dabei nur periphere Polyneuritis, aber keine zentralen Störungen des Nervensystems. Muskelveränderungen sind von sekundärer Natur. Die erste Lokalisa- tion der Lähmung ist in der Umgebung der Injektionsstelle. Die Derotheraphie ist nur innerhalb der ersten zehn Stunden nach der Intoxikation wirksam, später ist sie ohne Bedeutung. Wenn Lähmungen auftreten, ist öfter schon genügend Antitoxin im Blut vorhan- den, das aber die Lähmung nicht zu verhindern vermag. S. Tamura (808) konnte mit minimalen Dosen des Diphtherietoxins bei Küken Bein- paresen erzeugen. Diese Lähmungen können durch Zufuhr von Olivenöl mit der Nah- rung verhindert werden. Die wirksame Substanz des Öls befindet sich im ätherlös- lichen (im Azeton unlöslichen) Anteil seiner unverseifbaren Substanz. Ihre optimale Dosis liegt beim Gehalt von ca. 1 % des unverseifbaren in der Nahrung. Mehr davon wirkt schon schädlich. Die Substanz ist noch wirksamer bei der parenteralen Applikation. 99 Eine neue Auffassung über die Frage der Pathogenese der diphtherischen Lähmun- gen hat A. Beer (791) geäußert. Er betont, daß die ganz frühzeitigen Lähmungen (in den 1.—2. Krankheitswochen) sich in der nächsten Umgebung des Krankheitsherdes lokalisieren. Sie sind also wahrscheinlich von einer ganz anderen Genese, als die Spätlähmungen. Weiterhin fiel es ihm noch auf, daß bei den Spätlähmungen (in der 4.—5. Woche) ein langes Intervall zwischen dem Zeitpunkt der letzten Giftaufnahme und dem Ein- setzen der Lähmung verstreicht. Beer erklärt dies wiederum (wie im Falle der Spät- herzschäden bei Diphtherie — s. oben) durch Bildung von Toxin + Lipoid-Komplex- antigenen im Nervengewebe. Diese Antigene sollen das Nervensystem zu gewissen Abwehrreaktionen zwingen, als deren Folgen die Lähmungen auftreten. Der Angriffspunkt des Toxins soll im Ursprungsgebiet der peripheren motorischen Neuronen liegen. Die Veränderungen betreffen nicht die Ganglienzellen, sondern die Markscheiden der Nerven. Im Rückenmark soll es innerhalb umschriebener Herde zu zu der Entmyelinisierung kommen. Dabei entwickeln sich keine entzündlichen Reaktionen. Diese Hypothese der Bildung eines sekundären Toxinlipoidgiftes ist bisher experi- mentell noch nicht genügend nachgeprüft. 100 BIBLIOGRAPHIE Baustoffe und Wirkstoffe 1. Allgemeines und N-haltige Körper 1. v. Dzierskowski, S. and Rekowski. Recherches sur la transformation dfes milieux nutritifs par les bacilles de la diphterie et sur la composition chimique de ces microbes. Arch. Sei. biol. 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Serologische Beziehungen der Corynebakterien 13 4. Porphyrine und Flavine 17 5. Nukleinsäuren und Polkörnchen 18 III. Physiologische Grundleistungen 21 1. Verwendungsstoffwechsel und Wuchsstoffe 21 2. Energieliefernde Vorgänge 29 3. Kohlehydratvergärung 36 4. Urease bei den Corynebakterien 43 IV. Oiphtherietoxin .44 1. Toxinbildung in vitro 44 2. Toxinreinigung 49 3. Toxinentgiftung 55 4. Diphtherietoxin und Bakterienproteine 63 V. Pathologische Physiologie der Wirkung des Diphtherietoxins unter Berück- sichtigung der einzelnen Gewebe und Organe und der dadurch bedingten Stoffwechselstörungen 68 1. Toxinverteilung im Körper 70 2. Wirkung auf die Gewebskulturen in vitro 74 3. Wirkung auf die Gefäßwände — seröse Entzündung 75 4. Wirkung auf die Nebennieren. Beteiligung der Ascorbinsäure, Adrenalins, Gluthations usw 79 5. Wirkung auf die übrigen endokrinen Drüsen 88 6. Wirkung anderer Vitamine als C 89 7. Wirkung auf die Nieren, Stickstoffwechsel, Blutdruck 90 8. Wirkung auf den Kohlehydratstoff Wechsel 91 9. Beteiligung der Schwermetalle 94 10. Wirkung auf den Herzmuskel 96 11. Wirkungen auf das Gehirn und die peripheren Nerven 98 4. Bibliographie ’ 101 136