Sonderabdruck aus Hoppe-Seyler's Ztachr. f. physiolog. Chem. 236. Bd. (1935). Uber die Bedeutung der Fumarsdure fir die tierische Gewebsatmung’*), Von E. Annau, IL Banga, B. GUzsy, St. Huszik, K. Laki, B. Straub und A, Szent-Gytrgyi. Mit 12 Figuren im Text. (Aus dem Institut fiir medizinische Chemie, Universitét Szeged.) (Der Schriftieitung zugegangen am 20. Juli 1935.) ' Einleitung, Ubersicht, Methoden. Von A. Szent-Gytrgyi. Nach unserem heutigen Wissen ruht die Hauptatmung tierischer Gewebe auf. zwei groBen katalytischen Systemen, in denen die beiden Komponenten der Zelloxydation, Sauerstoft und Nahbrstoff, aktiviert werden. Wie die Untersuchungen War- burgs zeigen, wird einerseits der Sauerstoff aktiviert, indem er sich mit dem ,,Atmungsferment‘‘ verbindet, und das 2wertige Hisen seiner Hamatinkomponente zu 3wertigem Eisen oxydiert. Anderseits wird, wie uns Wieland lehrte, der Nahrstoff aktiviert, dessen Wasserstoffatome durch die Dehydrase aufgelockert werden, so daB sie in Gegenwart eines geeigneten ,, Wasserstoffaeceptors“ abgegeben werden kénnen. D. Keilin gebihrt das Verdienst, gezeigt zu haben, da8 Atmungsferment und Dehydrasen nicht unmittelbar mitemander reagieren, sondern da8 zwischen beiden eine Serie von Hamatinen, ,,Cytochrom“ genannt, eingeschaltet ist, die einerseits durch das Atmungsferment oxydiert, anderseits durch die Nahrstoffidehydrierung reduziert wird. In der Zelle stellt also dieses Atmungsferment—Cytochrom-System den physio- logischen Wasserstoffacceptor der Hauptatmung dar. Wir wollen *) Die Ausfiihrung dieser Arbeit wurde durch die Unterstiitzung der Josiah-Macy-Jr.-Stiftung New York ermdglicht. Hoppe-Seyler’s Zeitschrift f. physiol. Chemie. CCXXXVI. 1 2 A. Szent-Gyodrgyi, es im folgenden ,, Warburg-Keilin-System“ nennen und kurz- weg als ,,WKS“ bezeichnen. Das eingehende Studium tierischer Dehydrierung verdanken wir Thunberg, der zur Untersuchung dieser Funktion seine bekannte Technik einfihrte, mit der er zeigte, da8 die tierischen Gewebe zablreiche organische Substanzen zu dehydrieren ver- mégen und somit Dehydrase fiir solche enthalten. Die quantitative vergleichende Untersuchung der Dehydrasen war zur Zeit der ersten klassischen Untersuchungen Thunbergs wegen Unkenntnis der Co-Dehydrasen unméglich. In den letzten Jahren haben wir aber gelernt, da8 die volle Aktivitét zahlreicher Dehydrasen an die Anwesenheit: von Co-Dehydrasen, Substanzen der Gruppe der Adenylnucleotide, gebunden ist. Zwischen Dehydrierungen mit der Thunbergtechnik und dem AtmungsprozeB besteht in quantitativer Hinsicht eie gewisse Diskrepanz. Im AtmungsprozeB werden groBe Mengen von Sauer- stoff aufgenommen und es werden ebenso groBe Mengen von Wasserstoff durch die Dehydrasen mobilisiert. Hingegen werden durch den Thunbergversuch schon die schwichsten Dehydrierungen mit groBer Klarheit zum Nachweise gebracht. Es ist also deutlich, da8 eine gréBere quantitative Bedeutung bei der Atmung nur denjenigen Dehydrierungen zukommen kann, die mit einer groBen Intensitat verlanfen. Untersucht man von diesem Standpunkte aus — unter Mitverwendung der Co-Dehydrasen — die zahlreichen bekannten tierischen Dehydrasen bzw. Wasserstoffdonatoren, so ergibt sich, da8 sich unter ihnen nur eine geringe Anzahl be- findet, die ee geniigend intensive Aktivitét zeigt, um bei der Hauptatmung eine gréBere quantitative Roile spielen zu kénnen. In dem Material z. B., auf das sich unsere Untersuchungen beziehen (szerkleinerter Brustmuskel der Taube in Phosphat- lésung), fanden wir insgesamt nur 8 Dehydrasen, die dieser An- forderung einer hohen Aktivitét entsprachen, und zwar die De- hydrase fiir: 1. Bernsteinsiure [Thunberg, Battelli und Stern*)}], 2. Milchséure, 8. Glycerinaldehydphosphorsiureester [Gézsy)], 4. Glycerinphosphorséure [Ahlgren*)], 5. Hexose- monophosphat, 6. Hexosediphosphat [Broman, Thunberg*)], 7. Glhutamins&ure [Thunberg, Holmberg*)j, 8. Citronen- sture [Thunberg, Battelli und Stern*)]. *) Vgl. Euler u. Harrison, a. 2. 0. 8. 18. 3) Diese Z, 222, 278 (1933). Uber die Bedeutung der Fumarsiure fiir die tierische Gewebsatmung. 8 Mehrere dieser Dehydrasen sind aus verschiedenen tierischen Geweben schon seit langerer Zeit bekannt. Im wesentlichen haben alle diese Fermente iibereinstimmende Eigenschaften. Nur die Bernsteinsiuredehydrase zeigt besondere Ziige, die, wie z. B. ihre hohe Resistenz und Aktivitét, schon in den fritheren Tagen ihrer Erforschung auffielen. Vergleichen wir aber die genannten Dehydrasen unter Zuhilfenahme der uns heute zur Verfiigung stehenden Mittel, so wird die Ausnahmestellung der Succino- dehydrase durchaus iberzeugend : 1. Untersucht man die Kinetik genannter Dehydrasen, so ergibt sich, daB die Wirksamkeit der Fermente in ihrer Abhangigkeit von der Substratkonzentration einen fir Fermentwirkungen allgemein charakteristischen monomolekularen Typus zeigt. Wie aber Widmark?) entdeckte, zeigt die Succinodehydrase einen durchaus verschiedenen Verlauf und gibt schon bei minimaler Substratkonzentration eine maximale Wirkung, gehért also den Reaktionen vom sog. Nulltypus zu. 2. Alle genannten Fermente bediirfen zu ihrer vollen Aktivitat einer Co-Dehydrase. Allein die Succinodehydrase wird durch Co- Dehydrase nicht beeinfluBt. 3. Im Respirometer verbraucht der gewaschene Muskel in Gegenwart von Bernsteinsiure entsprechend der starken De- hydrierung im Thunbergversuch groBe Mengen Sauerstoff. Der aktivierte Wasserstoff der Bernsteinsiiure wird also unmittelbar durch das anwesende WKS oxydiert. Hingegen vermégen die anderen Substanzen nicht — obwohl sie im Thunbergversuch ebenso energisch dehydriert werden — den Sauerstoff als Acceptor zu gebrauchen*). Da das Vermégen desselben Fermentpraparates, Bernsteinsiure aerob zu oxydieren, beweist, da8 in ihm WKS in geniigender Aktivitiét vorhanden ist, mu geschlossen werden, daB im Gegensatz zur Bernsteinsiuredehydrase die anderen Dehydrasen mit dem WKS nicht in unmittelbarer Verbindung stehen. 4, Vom Blickpunkte des Zwischenstoffwechsels ist bemerkens- wert, daB abgesehen von der Bernsteinsiure, Glutaminsiure und Citronensdure die genannten Verbindungen der C,-C,-Gruppe angehéren, die dort eine so bedeutende Rolle spielen. Hingegen 2) Skand. Arch. Physiol. 41, 200 (1921). *) Nur das Hexosediphosphat vermag eine relative geringe Menge von Sauerstoff aufzunehmen. 1* 4 A. Szent-Gydrgyi, ist von der 4(C-atomigen Bernsteinséure keine solche Rolle nachgewiesen. . 5: Im gleichen Sinne spricht auch das Bestehen der von Einbeck?) entdeckten Fumarase, die Fumarsiure, das Oxydations- produkt der Bernsteinsiiure, unter Wasseraufnahme zu Apfel- sdure verandert. Aus reiner Fumarsiure entsteht unter Ein- ‘wirkung von Fumarase ein im Gleichgewicht stehendes Gemisch von Fumar- und Apfelséure im Verhaltnis 1:8. Reine Apfelsaure wird durch Fumarase unter Wasseraustritt ebenfalls in das Gleich- gewichtsgemisch wiberfihrt. Zusammen mit der Bernsteinsiuredehydrase ist Fumarase eines der aktivsten bekannten Fermente. Was soll es nun be- deuten, da8 die Zelle fir Bernsteinsiure, Fumarsaure, Apfelsiure die aktivsten Fermente beherbergt, die regelmaBig offenbar nicht als Zwischenstufen im Abbau der Nihrstoffe entstehen? 6. Auf die ganz besondere Funktion der C,-Dicarbonséuren wies zuletzt auch die immer noch unerklarte, merkwiirdige Be- obachtung Thunbergs*) hin, daB Maleinsiiure die Atmung weit- gehend vergiftet, obwohl sie selber als Donator auftritt. Malein- sdure hat keinen KinfluB auf die bekannten Glieder des Atmungs- systems, und ihre einzige besondere Higentiimlichkeit ist die, daB sie auch dieser merkwiirdigen Gruppe der C,-Dicarbonsauren angehort. Diese Beobachtungen lieBen vermuten, daB8 den C,-Dicarbon- siuren und den zugehérigen Fermenten ihren besonderen Higen- schaften entsprechend auch eine besondere Funktion zukommt, und daB diese an der Atmung nicht als N&hrstoffe, sondern als Katalysatoren beteiligt seien. Um weitere Anhaltspunkte zu bekommen, wurden durch zwei von uns [Gézsy und Szent- Gyérgyi5)| Versuche ausgefiihrt, die neue Beweise fir die Aus- nahmestellung der genannten Substanzen erbrachten. Es wurde versucht, die Bernsteinsiuredehydrase in spezifischer Weise aus- zuschalten, um zu beobachten, welchen Hinflu8 dies auf die Atmung habe. Dies konnte auf Grund der Arbeit von Quastel®), sowie Quastel und Wooldridge”) durch Malonat geschehen. Es zeigte sich, daB die Atmung durch Malonat weitgehend gehemmt wird, 5) Biochem. Z. 95, 297 (1919). *) Skand. Arch. Physiol. 40, 1 (1920). 5) Diese Z. 224, 1 (1984). *) Biochemic. J. 20, 166 (1926). 7) Biochemic. J. 22, 689 (1928). Uber die Bedeutung der Fumarsaure fir die tierische Gewebsatmung. 5 obwohl dieses Gift weder Nahrstoffdehydrierung, noch Sauerstoff- aktivierung beeinflu8t. Die Intensitét der Giftwirkung ist von derselben GréBenordnung wie die des Cyans. Kommt also den C,-Dicarbonsiuren bei der Atmung eine katalytische Rolle zu, und wurde durch ihre Ausschaltung die Atmung stillgelegt, so muBte auch versucht werden, ob durch ihre Zugabe die Atmung nicht erhéht wird? Eine Atmungssteigerung durch Fumarat wurde bereits durch Thunberg®) beobachtet und von Grénwall) studiert. Gézsy und Szent-Gyérgyi zeigten, da8 die Fumar- sdure unter Umstinden die Atmung um mehrere 100°/, zu steigern vermag. Das besonders eigentiimliche dieser Steigerung war aber, daB das Fumarat hierbei nicht verbraucht wurde, also im Gegen- satz zu anderen &bnlichen beschriebenen atmungssteigernden Sub- stanzen nicht als Donator, sondern als Katalysator wirkte. DaB es sich hier nicht um die Aktivierung eines kinstlich hergestellten Systemes handelt, zeigen die hier zu berichtenden Analysen. Nach Banga wird durch Pumarat die Atmung eigent- lich nicht ,,gesteigert‘‘, sondern nur ,,konserviert‘’. Das in Phos- phat suspendierte Gewebe verliert gewdhnlich rasch von der Intensitaét seiner Atmung. Dieses Sinken der Atmung wird durch Fumaratzusatz hintangehalten. Das Gewebe enthé]t normaler- weise geringe Mengen Fumarat, die bei der Suspendierung des Gewebes durch Diffusion verloren gehen; deshalb sinkt die Atem- héhe. Wird das Wegdiffundieren durch Kompensationsdialyse (d.h. durch Zufiigung von Fumarat aur AuSenfliissigkeit) ver- hindert, so bleibt die Atmung erhalten. Von groBer Bedeutung bierbei ist der Umstand, daB zur Erreichung solcher Wirkungen schon sehr kleine Fumarat- konzentrationen geniigen, die der normalen Fumaratkonzentration des Muskels gleich sind. Dieser Umstand entkraftet den Einwand, daB das Fumarat des Muskels wegen seiner geringen Konzentration fiir die Atmung keine Bedeutung haben kénne. Es lag auf der Hand daran zu denken, daB das Succinat den Wasserstofftransport zwischen Nahrstoffdehydrase und WKS ver- mittle, indem es durch letzteres zu Fumarat oxydiert, durch erstere zu Succinat reduziert wird. Es ist bekannt, da8 an der Succino- dehydrase nicht nur das Succinat unter Dehydrierung als Donator, sondern ebenso energisch auch das Fumarat unter Hydrierung 8) Skand. Arch. Physiol. 24, 23—86 (1911). ®) Skand. Arch. Physiol. 45, 303 (1924). 6 A. Szent-Gyérgyi, als Wasserstoffacceptor aktiviert wird. Diese einfache Theorie hatte all den aufgezihlten Beobachtungen eine befriedigende Er- klérung gegeben. Die Theorie stand aber im Widerspruch mit folgenden Beobachtungen: 1. Wie Gézsy und Szent-Gyérgyi fanden, ist die durch Fumaratzusatz stabilisierte Atmung nicht durch Malonat hemm- bar. Liefe der Wasserstofftransport tiber die Succinodehydrase, so muBte die Atmung in jedem Fall durch Malonat gehemmt werden. 2. Das dem Muskel unter anaeroben Bedingungen zugesetzte Fumarat wird nicht oder nur aéuBerst langsam reduziert. 8. Malonat entfaltet seine Atmungshemmung, Fumarat seine Atmungssteigerung nur in Phosphat und nicht in Ringerlésung. Es konnte nicht angenommen werden, daB ein fundamentaler ProzeB sich je nach der Suspensionsfliissigkeit verschieden ver- halte. 4. Das dem gewaschenen Muskel zugesetzte Succinat war nicht imstande, die fehlende- Verbindung zwischen Nahrstoff- dehydrasen und WKS herzustellen. 5. Die Theorie gab keine Erklirung fiir die Funktion der Fumarase. Wiahrend also einerseits Beobachtungen in zwingender Weise zeigten, da® das Fumarat als Katalysator im Mittelpunkte der Atmung stehe, zeigten Versuche ebenso deutlich, daB die Atmung nicht tiber die Succinodehydrase, d. h. iber den Wechsel Succinat— Fumarat laufen kénne. Es wurde also untersucht, ob das Fumarat die Funktion des. Wasserstofftransporteurs nicht durch seinen Wechsel mit einer héheren Oxydationsstufe ausiiben kénne. Um nun festzustellen, welche von den méglichen niachst héheren Oxydationsstufen in Frage kommen kann, wurde in doppelter Weise vorgegangen. Hinerseits untersuchte Banga, welche von den in Betracht kommenden Substanzen das Fumarat in seiner stabilisierenden Wirkung ersetzen koénne. Ks zeigt sich hierbei, da8 in dieser Hinsicht wohl nur die Oxalessigsiéure aktiv ist und in jeder Beziehung der Fumarsiure gleich wirkt. Ander- seits untersuchte Laki, welche von den in Betracht kommenden Substanzen im Gewebe als Acceptor aktiviert wird. Dies war tiberhaupt nur mit der Oxalessigsiure der Fall. Ist also das Fumarat mit einer héheren Oxydationsstufe an der Atmung be- teiligt, so kann diese hdhere Oxydationsstufe nur die Oxalessigsaéure sein. Fir eine mégliche Bildung von Oxalessigsiure aus Fumarat Uber die Bedeutung der Fumarsaure fir die tierische Gewebsatmung. 7 haben bereits Hahn, Haarmann und Fischbach!) Beweise erbracht. Nachdem also unsere Aufmerksamkeit auf die Oxalessigsiure gelenkt war, muBte zunichst die mégliche Oxydation des Fumarais und Reduktion des Oxalacetats untersucht werden. In diesen, durch Banga ausgefiihrten, von Gézsy erginzten Versuchen zeigte sich, daB das untersuchte Gewebe (Taubenbrustmuskel in Phosphat) die zugesetzte Oxalessigsiure mit groBer Geschwindig- keit zum Verschwinden bringt. Nach Straub kommt der Schwund durch Reduktion zu Fumarat zustande. Die durch das Gewebe in der Zeiteinheit reduzierbare Menge des Oxalacetats iibertraf in Aquivalenten den gesamten, bei der Atmung aufgenommenen Sauerstoff, so da festgestelli werden konnte, daB Oxalacetat durch das Gewebe mit einer geniigenden Geschwindigkeit redu- ziert werden kann, um die gesamte Atmung baw. den Transport des gesamten Wasserstoffes zu tragen. Bestand nun die Atmung gem&B unserer Anschanung aus einer wechselnden Oxydation und Reduktion des Fumarats, so war es aus den genannten Angaben deutlich, daB die Reduktion des Oxalacetats rascher als ihre Bildung aus Fumarat verlaufen miisse und da8 man somit beim in Phosphat suspendierten Muskel auch bei Fumaratzugabe kein Oxalacetat nachweisen kénne. Die Bildung des Oxalacetats kénnte nur nachgewiesen werden, wenn es gelang, seine Reduktion staérker als seine Bildung zu hemmen. Dies gelang mit Arsenit. Wird das Gewebe mit Arsenit aerob bebriitet, so wird die Wasserstoffaktivierung der Nahrstoffe weit- gehend unterdriickt!1). Hs schemt, da®8 durch diese Arsenit- behandlung die Dehydrasen vergiftet werden. Nicht alle De- hydrasen leiden aber in gleicher Weise. Wahrend z. B. die Milch- siuredehydrase ganz vernichtet wird, wird die Succinodehydrase, die Glutaminsiure- und Hexosediphosphatdehydrase nicht oder nur wenig gehemmt. Auch die Fumardehydrase gehért zur Fer- mentgruppe, die durch die Arsenitbehandlung weniger leidet. Durch das Arsenit wird die Wasserstoffmobilisieruang der Nahr- stoffe in héherem MaSe wie die Fumaroxydation unterdrickt, so daB sich also hier die Méglichkeit einer Anreicherung von Oxal- 39} Hahn, Haarmann, Z. Biol. 87, 465 (1928); Hahn, Haarmann u. Fischbach, Ebenda 88, 587 (1929). 11) Szent-Gyérgyi, Biochemic. J. 24, 1723 (1930); I. Banga, L. Schneideru. A. Szent-Gyérgyi, Biochem. Z. 240, 462 (1931); I. Banga, A. Szent-Gyérgyi, Biochem. Z. 246, 203 (1932). 8 A. Szent-Gyérgyi, acetat und damit seines Nachweises ergibt. Es konnte aber nicht erwartet werden, die gesamte gebildete Oxalessigsiure wieder- zafinden, da einerseits die Fumardehydrase durch Arsenbehandlung selber auch leidet, andererseits die Wasserstoffmobilisierung, wie auch die gesamte Atmung durch Arsenit nicht giinzlich, sondern bloB zu 70—75°/, unterdriickt wird. Arsenit verursacht also keine quali- tative Anderung, sondern bloB eine Verschiebung der normalen Verhaltnisse. Diese Verschiebung ist aber groB genug, um das Oxalacetat zum Nachweis zu bringen. Wurde das Gewebe mit Arsen vorbehandelt, dann mit Fumarat bebriitet, so trat Oxal- acetat in nicht unbetrichtlicher Menge auf. Lauft der gesamte Wasserstofitransport iber Fumarat-Oxyfumarat, so muB 1 g Ge- webe in 10 Minuten insgesamt annibernd 8 mg Oxyfumarat (die dem verbrauchten O, aquivalente Menge) bilden. Hiervon konnte mit Hilfe des Arsenits 1 mg tatsichlich nachgewiesen werden. Abnlich, wie Arsenit, wenn auch schwicher und weniger gu- verlaBlich, wirkte auch Maleinat (0,05 Mol.). _ Stand nun die Bildung des Oxalacetats fest, so galt es, ein entsprechend aktives Ferment der Oxydation des Fumarats nach- guweisen. -2mal gewaschener Muskel vermag Farbstoffe in Gegen- wart von Fumarat auch mit Co-Dehydrasezusatz nur sehr schwach zu dehydrieren. Also entweder ist keme Fumardehydrase im Gewebe vorhanden, oder aber sie muBte beim Auswaschen ver- schwinden. Ungewaschenes Gewebe kann aber wegen der starken spontanen Reduktion nicht zum Thunbergversuch verwendet werden. Wurde durch Arsen vorbehandeltes Gewebe heran- gezogen, das Farbstoffen gegeniiber ein stark vermindertes Ent- firbungsvermégen hatte, so wurde durch Fumaratzusatz die Ent- farbungszeit stark vermindert, als Zeichen dessen, da8B das Gewebe eine intensive Fumardehydrase enthielt. Die weitere Analyse zeigte, daB durch das Waschen des Muskels die Fumardehydrase nicht inaktiviert; sondern bloB herausgelést wurde und aus der Waschflissigkeit mit hoher Aktivitét und relativer Reinheit zuriickgewonnen werden konnte. Das auf diese Weise hergestellte Fermentpriparat zeigte, daB die Fumardehydrase eine sehr hohe Aktivitaét besitat, die, beurteilt nach der Entfarbungszeit, geniigend gro8 ist, um die gesamte Atmung bzw. den gesamten Wasserstoff- transport tragen zu kénnen. Lakis Messungen zeigten auch, daB dieses. Ferment — ahnlich der Bernsteinsiiuredehydrase — so gebaut ist, da es fahig ist, schon mit minimalen Substratmengen maximal zu arbeiten, so daB also auch in dieser Beziehung nichts Uber die Bedeutung der Fumarsiure fiir die tierische Gewebsatmung. 9 der Annahme im Wege steht, daB dieses Ferment, zusammen mit der natiirlicherweise im Muskel anwesenden Fumarsiiure, die ge- samte Atmung vermittele. Wahrend aber die Bernsteinsiuredehydrase in gleicher Weise O, und Farbstoffe als Wasserstoffacceptoren zu benutzen vermag, ist die Fumardehydrase unfahig, O, als Acceptor zu gebrauchen, d. h. aerob Fumarat zu Oxalacetat zu oxydieren, obwohl die Fumar- dehydrasepraparate stets eine aktive Succinodehydrase und damit auch ein aktives WKS enthalten. Die weitere Arbeit Bangas ergab, daB im Muskelgewebe ein thermolabiler Faktor anwesend ist, der die Fumardehydrase be- fahigt, O, als Wasserstoffacceptor zu gebrauchen, d. h. Fumarat aerob zu Oxalacetat zu oxydieren. Die chemische Natur dieser Substanz, die die Fumardehydrase mit dem WKS verbindet, wurde noch nicht naher untersucht. Die Substanz soll fortan »4wischensubstanz genannt werden. Wie eingangs erwihnt, ist das System: Nahrstoffdehydrase, Nahrstoff, plus WKS unfahig, Sauerstoff aufzunehmen, da die Verbindung zwischen den beiden Fermenten feblt. Wird hin- gegen dieser Komplex mit folgenden Gliedern ergiinzt: Fumar- dehydrase, thermolabiler Faktor plus Fumarat, so erhalt man ein System, das alle typisehen Higenschaften der Normalatmung (Malonhemmbarkeit, Steigerung durch Fumarat) zeigt, als Zeichen dafiir, daB mit Hinfiigen dieser Glieder der Atmungszyklus voll- standig geworden ist. Es JABt sich also sagen, daB in der Kette der biologischen Oxydation zwischen WKS und Nahrstoffdehydrierung ein System des Wasserstofftransports eingeschaltet ist. Dieser Wasserstoff- transport wird durch die Fumarsdure vermittelt, die — aktiviert durch die Fumardehydrase — abwechselnd zu Oxalacetat oxy- diert, und wieder zu Fumarat reduziert wird. Die Oxydation des Fumarats wird, dem WKS zu, durch die noch nicht naher definierte Awisehensubstanz vermittelt. Auf Grund dieser Ergebnisse kann also das Atmungssystem folgendermaBen dargestellt werden: aubstanz Fumardehydrase Nahbrstoffdehydrasen 0.—WKS—Zwischen- Fumarat =”. Oxalacetat Nahrstoffe Co-Dehydrase Co-Dehydrasen Dieses Atmungsschema gibt aber keine Erklarung fir die Atmungshemmung durch Malonat, die in unserer ganzen Arbeit zusammen mit der Fumarkatalyse die fundamentale Beobachtung 10 A. Ssent-Gyérgyi, bildete. Die Fumardehydrase ist ebenso wie die anderen Glieder dieser Kette, malonunempfindlich. Das Problem des Mechanismus der Malonathemmung wurde in eindeutiger Weise durch Straub gelést. Die von Straub aus- gebaute Mikrofumarsiurebestimmung gestattete es, das Schicksal der Fumarsiure unter Wirkung des Malonats quantitativ zu ver- folgen. Diese Fumarsiurebestimmungen zeigten, da8 unter Ein- wirkung des Malonats die Fumarséure verschwindet und hierdurch die Fumardehydrase ihr Substrat und die Zelle ihren katalytischen Wasserstofftransporteur verliert, wodurch die Atmung zum Still- stand kommt. Die Versuche Straubs wurden durch Gézsy erginzt, der mit seiner Mikrobernsteinsdiurebestimmungsmethode zeigte, daB das verschwundene Fumarat zu Bernsteinsiéure reduziert wird und als solches nachgewiesen werden kann. Hierdurch klarte sich auch der Mechanismus des Fumaratschwundes: im AtmungsprozeB wird stets ein geringer Teil des anwesenden Fumarats zu Bernsteinséure reduziert. Unter normalen Umstinden wird diese Bernsteinsdure durch die Succinoxydase sogleich wieder zu Fumarat reoxydiert und somit ihrer Funktion zuriickgegeben. Die besondere Kinetik der Bernsteinsiuredehydrase befihigt dieses Ferment, schon die geringsten Spuren des entstandenen Succinats mit maximaler Geschwindigkeit, unverziiglich zu reoxydieren. Durch Malonat wird die Succinodehydrase vergiftet und somit wird auch diese Reoxydation des Succinats verhindert. Hiermit erklarte sich also nicht nur der Mechanismus der Malonathemmung, sondern zugleich auch die Funktion und besondere Kinetik der Succinodehydrase. Obwohl die, durch die Suceinodehydrase in der beschriebenen Weise, durch Reoxydation des Succinats vermittelte Sauerstoft- aufnabme nur einen geringen Teil (5°/,) der gesamten Sauerstoff- aufnahme des Gewebes bildet, bleibt bei Vergiftung der Bernstein- siureoxydase die Atmung stehen, da die geringe Menge der als Katalysator wirkenden Fumarséure, bald zu Bernsteinsiure redu- ziert, nicht mehr reoxydiert, und somit ihrer Funktion entzogen wird. Durch Inaktivieren der Succinodehydrase wird durch das Malonat dem Fumarat gleichsam eine Falle gelegt, in dem es als Succinat gefangen und als solches stabilisiert wird. 1 g Gewebe reduziert in dieser Weise in 10 Minuten kaum mehr als 0,5 mg Fumarat zu Succinat. Die Menge der natiirlich an- wesenden Fumarsaure ist aber so klein, daB bereits diese schwache Reduktion geniigt, um unter Wirkung des Malonats die gesamte Uher die Bedeutung der Fumarsdure fiir die tierische Gewebsatmung. 1] Menge des natirlichen Katalysators binnen 2 Minuten als Bern- steinséure zum Schwinden zu bringen. Durch diese Messungen erlangt auch die zweite, sonst so widerspruchsvoll erscheinende Beobachtung, daB Malonat wohl die natiirliche, nicht aber die durch Fumaratausatz stabilisierte Atmung hemmt, eine einfache Erklarung. Wahrend der Muskel in Gegenwart von Malonat die natiirlicherweise anwesenden 0,04 mg Fumarat in 2 Minuten zu Succinat umsetzt, bendtigt er zur Umsetzung der gewohnlich zugesetzten 2,4 mg Fumarat zwei volle Stunden, wihrend welcher Zeit die Atmung trotz der An- wesenheit des Malonats ungehindert weiter gehen kann. Da unsere Versuche nie linger als 1 Stunde fortgesetzt wurden, kam die Hemmung nicht mehr zur Beobachtung. Mit geringeren Mengen des Fumarats erhélt man in Gegenwart von Malonat zuerst die erwartete Atmungssteigerung, dann aber, nach der fiir die Re- duktion deg Fumarats nétigen Zeit, die erwartete Atmungs- hemmung. Unerwarteterweise scheint das Succinat nicht aus Fumarat, sondern durch eine ,,Uberreduktion“ aus Oxalacetat gebildet zu werden, da diese Reduktion zu Succinat nur bei aerober Bebrittung stattfindet, wenn der Fumarsiure Gelegenheit gegeben ist, sich zu Oxalacetat zu oxydieren. Anaerob wird in Gegenwart von Malonat kein Succinat gebildet. Der mittlere Teil des obigen Atmungsschemas mu8 also folgendermaBen erginzt werden: Succinat a an — cet Fumardehydrase Co-Dehydrase Die gebrochene Linie gibt die Stelle an, an der Malonat wirkt und den Atmungszyklus unterbricht. Aus diesem Atmungsschema wird es deutlich, daB Malonat nicht, wie z. B. Cyan, in einer absoluten Weise wirken kann. Das AusmaB der Malonathemmung wird von dem relativen Verhaltnis einer Reihe von Prozessen abhingen. An erster Stelle wird die Succinodehydrase durch Malonat nicht vollstindig vergiftet. Hine geringe Oxydation des Succinats geht auch in Gegenwart von 12 A. Szent-Gyérgyi, Malonat stets vor sich. Die Geschwindigkeit dieser Oxydation ist von den relativen Mengen des bereits gebildeten Succinats und des zugesetzten Malonats abhangig. Das gebildete Succinat wird also, wenn auch langsam, doch auch in Gegenwart von Malonat mit gut definierbarer Geschwindigkeit oxydiert, so daB Malonat nie eine 100°%,ige Atmungshemmung geben kann. Das AusmaB der Malonathemmung wird also von der relativen Intensitét der Reduktion des Oxalacetats zu Succinat und der Reoxydation des Succinats abhingen. Die Intensitit dieser Reduktion des Oxalacetats zu Succinat mu wieder eine Funktion der relativen Leistungsfaihigkeit der Fumaratoxydation und der Wasserstoff- mobilisierung der Nahrstoffe sein. Ist unter diesen beiden Pro- zessen die Oxydation des Fumarats relativ stark, so wird der aktivierte Wasserstoff durch dieses aufgebraucht und es bleibt kein WasserstoffiiberschuB, der zu einer Uberreduktion des Oxal- acetats fihren kénnte. In diesem Falle muB das zugesetzte Malonat relativ wirkungslos bleiben. Ebenso bleibt auch das Fumarat wirkungslos, da doch bereits ohne Fumaratzugabe Oxalacetat im Uberschu8 vorhanden ist. Ist hingegen die Wasserstoffmobili- sierung relativ stark, wie dies in Phosphat (dank der starken Phos- phorylierang) der Fall ist, so wird es eher zu einer Uberreduktion des gebildeten Oxalacetats und somit zu einer starken Malonat- hemmung kommen. Diese intensivere Wasserstoffmobilisierung wird auch in einer intensiveren Atmung ihren Ausdruck finden. Von diesen Bedenken geleitet, hat Straub bei einer gréBeren Anzahl von Versuchen die gemessene Atmungsintensitét mit der Malonathemmung und der Succinatbildung in ein Koordinaten- system gebracht, und gefunden, daB beide GréBen, sowohl die Malonathemmung, wie die, mit ihr im Wesen identische Succinat- bildung Funktionen der Atmungsintensitat sind. Die Bildung des Oxalacetats ist von Phosphaten unabhangig lauft also, wie Banga zeigte, mit gleicher Intensitét in Phosphat- oder Ringerlésung. Nicht so die Wasserstoffmobilisierung der Nahrstoffe. Schon mit Zuhilfenahme von Farbstoffen oder Oxal- acetat laBt sich zeigen, da8 in Ringerlésung die Wasserstoffmobili- sierung gegeniiber Phosphat deutlich vermindert ist. In Ringer- lésung verschiebt sich also das Verhiltnis der Fumaratoxydation und der Wasserstoffmobilisierung zugunsten des ersteren. Diese Verschiebung konnte durch Banga in eindeutiger Weise de- monstriert werden. In einer gréBeren Anzahl von Versuchen zeigte Banga, daB, waihrend der in Phosphat suspendierte Muskel aus Uber die Bedeutung der Fumarsaure ftir die tierische Gewebsatmung. {18 Fumarat kein Oxalacetat bildet bzw. dieses ebenso rasch wieder reduziert, wie es gebildet wird, im Muskel, der in Ringerlésung suspendiert und mit Fumarat bebriitet wird, stets Oxyfumarat in deutlich nachweisbaren Mengen vorgefunden wird. Dement- sprechend fand auch Straub, daB der in Ringerlésung suspendierte Muskel auch in Gegenwart von Malonat kein Fumarat zu Succinat reduziert, oder aber diese Reduktion ist, verglichen mit Phosphat, nur auBerst gering und kommt nur bei sehr geringen zugesetzten Fumaratmengen zur Beobachtung ( bei denen nur wenig Succinat angehiuft werden kann, somit die Geschwindigkeit der Reoxy- dation des Succinats gering bleibt). Dies erklart dann auch die sonst so widerspruchsvoll erscheinende Beobachtung, daB zu- gesetztes Malonat und Fumarat in Ringerlésung viel weniger wirken oder ganz unwirksam bleiben. Das auf §. 16 wiedergegebene Atmungsschema gibt also ein befriedigende Erklarung fiir alle in dieser Arbeit beschriebenen Beobachtungen. Nur einer der eingangs aufgezihlten Punkte blieb unbeantwortet, die Frage nach der Bedeutung der Fumarase. Diese Frage hingt mit dem zur Zeit noch ungelésten Problem der primiren Reaktionsprodukte zusammen. Die Modglichkeit steht ginzlich offen, daB bei der Oxydation des Succinats nicht, wie allgemein angenommen, Fumarat, sondern Malat entsteht und die Fumarase die Aufgabe hitte, dieses Malat in Fumarat um- zusetzen. Ebensowenig wissen wir mit Sicherheit, was das primaire Reduktionsprodukt der Oxalessigsiure ist. Dieses kann kaum eine andere Substanz sein als Apfelsiure und die wahrscheinliche Funktion der Fumarase ist die, diese Apfelsiure zu Fumarat um- gasetzen, da Malat, wie durch Laki gezeigt, selber nicht -de- hydriert wird. Unbekannt ist auch das primaére Oxydationsprodukt des Fumarats. Aller Wahrscheinlichkeit nach ist dies das Oxyfumarat, das sich in neutraler Lésung rasch zum gréften Teil in die Keto- form umsetzt. Ob Oxyfumarat in den Geweben schon als solches oder erst als Oxalacetat reduziert wird, wird wohl von den noch unbekannten relativen Geschwindigkeiten der einzelnen Prozesse abhingen *). Da Oxyfumarat, Oxymalemat und Oxalacetat in neutraler Lésung miteinander im Gleichgewichte stehen, ist es *) Wird der gesamte Wasserstofftransport von Fumarat getragen, so mu8 jedes Molekiil des ,,Fumarata‘’ im Muskel annibernd 8mal in der Minute oxydiert und reduziert werden. 14 A. Szent-GySrgyi, unmoglich, experimentell unter diesen drei Substanzen zu unter- scheiden. Darum wird in vorliegender Arbeit: durchweg nur iiber »,Oxalacetat’’ gesprochen, mij dem Vorbehalte, da8 es ganz offen bleibt, mit welcher Form die Substanz tatsichlich in Reaktion tritt. Es sei nun zum Schlu8 nachdricklich betont, da8 alle unsere Untersuchungen sich in erster Linie auf zerkleinerten, in Phosphat suspendierten Brustmuskel der Taube beziehen. Solch ein Muskel ist kein ruhender, normaler Muskel und die Verhiltnisse in diesem System sind den normalen gegeniiber stark verzerrt. Es kam uns aber nicht darauf an, die Verhiltnisse des normalen, ruhenden Muskels festzustellen, sondern den Mechanismus zu erforschen, der die Grundlage der Atmung bildet. Erst durch diese Verzerrung der normalen Verhiltnisse ist die vorliegende Analyse ermdglicht worden. Es ist eine Grundbedingung fiir die Analyse eines so komplexen, innerlich ausgeglichenen Systems, wie die Atmung, den Mechanismus zu verzerren oder zu zerlegen und hierdurch seine einzeinen Teile in Erscheinung treten zu lassen. Es fragte sich zuletzt, ob sich die mit zerklemertem Muskel erhobenen Befunde auch auf andere Gewebe tibertragen lassen, eine Verallgemeinerung erlauben, oder aber nur einen Spezialfall bilden. Es war wiinschenswert, die Versuche mit einer Methode zu wiederholen, die den physiologischen Bedingungen niher steht. Dieser Aufgabe hat sich Annau unterzogen. Er findet, daB die erhobenen Befunde sich auf andere Gewebe, wie Leber und Niere, iibertragen lassen. Aus diesen Geweben. kénnen, im Gegensatz zum Muskel, auch Schnitte angefertigt werden, die durch manche Forscher als mit normalem Gewebe gleichwertig betrachtet werden. Daher wurde die Untersuchung auf Schnitte ausgedehnt, und Annauw findet, daB im Verhalten der Schnitte und des an der Latapimaschine hergestellten Gewebsbreies keine wesentlichen Untersehiede bestehen. Gleichzeitig zeigte Annau, daB das auf den Fumaratzyklus spezifisch einwirkende Malonat tiefgreifende Verschiebungen im chemischen Mechanismus des intermediaren Stoffwechsels verursacht, ein weiterer wichtiger Beweis, daB der durch Malonat beeinflu8te Mechanismus im oxydativen Zellstoff- wechsel eine zentrale Rolle spielt. Immerhin aber hat man keine Sicherheit, daB selbst die Gewebeschnitte die normalen Verhiltnisse widerspiegeln. Darum hat es Huszak untemommen zu untersuchen, ob die Ver- schiebungen im Chemismus des Stoffwechsels, die in vitro be- Uber die Bedeutung der Fumarsaure fir die tierische Gewebsatmung. 15 obachtet wurden, auch im ganzen Tier reproduzierbar sind. Wie im letzten Toile dieser Arbeit berichtet, werden soll, ist dies tatsichlich der Fall. Zum Schlusse seien noch zwei Umstinde namhaft gemacht, die die beschriebene Rolle des Fumarats bedenklich erscheinen lassen kénnten. Seit Neuberg und Tirs!*) Untersuchungen ist es bekannt, daB Oxalessigsiure durch Gewebe zu Brenztrauben- siiure decarboxyliert wird. Nach Wieland?%) soll sogar gekochter Muskel ahnlich wirken. Hahn, Haarmann und Fischbach*) haben sich mit diesem ProzeB eingehend beschiftigt. Wird das Oxalacetat decarboxyliert, so ist es fir die katalytische Funktion des Wasserstofftransportes verlorengegangen. Diese Decarboxy- lierung ist aber ein relativ langsamer Proze8, wihrend dessen die Lebensdauer der einzelnen Oxalessigsduremolekiile dank der raschen Reduktion nur sehr kurz sein kann. Sollte sich Oxalacetat aus irgendeinem Grunde anhéufen, so kann die Decarboxylation sicherlich zum Schwunde der Substanz fahren. Huszaks und Straubs Arbeiten geben direkte Beweise dafiir, daB dies auch tatsachlich der Fall sei, und daB das Fumarat, das nicht zur Kata- lyse nétig ist und somit nicht mit geniigender Geschwindigkeit reduziert wird, taisichlich auch auf diesem Wege verschwindet. Sollten im Stoffwechsel stets geringe Mengen Succinats bzw. Fumarats gebildet werden, so wird ihr zur Katalyse unnétiger Uberschu8 durch diese von Hahn und Mitarbeitern beschriebene Reaktion entladen, die gleichsam wie der Abflu8 am Wasser- bade wirkt. Es mag vielleicht befremdend wirken, einer so einfachen Substanz wie Fumarat eine so grundlegende Funktion zuzuschreiben. Hs sei aber darauf hingewiesen, daB Succinat bzw. Fumarat — strukturchemisch betrachtet — ganz einzig dastehende Sub- stanzen sind. Bekanntlich haben die «- und f-C-Atome stets besondere Higenschaften, die sich in ihrer besonderen Reaktions- fahigkeit kundgeben. Nun gibt es bloB eine Substanzgruppe, die zwei vizinale C-Atome enthalt, die beide zugleich «- und £-C-Atome sind: die Gruppe der C,-Dicarbonsiuren. In vorliegender Arbeit wird die Literatur und Geschichte méglichst kurz gehalten. An Stelle der ausfithrlicheren Besprechung verweisen wir auf die von H.v. Euler herausgegebene Mono- 12) Biochem. Z. 82, 380 (1911). 18) Liebigs Ann. 436, 229 (1923). M4) Vel. a.ea. O. S. 11. 16 A. Szent-Gydrgyi, graphie: Euler, W. Franke, R. Nielsson und K. Ziele, Die Katalasen und die Enzyme der Oxydation und Reduktion (Verlag J. F. Bergmann, Miinchen 1984), sowie die Geschichte der Dehydro- genase und der Co-Dehydrasen von D.C. Harrison, Erg. d. Enzymforschung 4, 297 (1935). Als Zusammenfassung des Gesagten sei hier das oben an- gefiithrte Atmungsschema wiederholt, in dem, anlehnend an War- burg"), an Stelle des WKS die Reihe der Himatine eingetragen ist. Dieses Schema wird in der nichsten Zukunft wahrscheinlich noch durch einen Zyklus erginzt werden, in dem die Fumarase ihre Wirkung ausiibt. 0, + Fet+—Fett+—Fett—Fet++—Fett— Fet++—-Fet+— Fet++— Zwischen- Atmungs- Cytochrom Cytochrom Cytochrom ferment Succinat ~* ala | g ae | Co ™ Fumarat—Oxalacetat sobatana—| Fumardehydrase {—Nahratoffdehydrasen Co-Dehydrase Co-Dehydrase + Nahrstoffe Methodisches. Um Wiederholungen vorzubeugen, sollen hier kurz die in den nach- folgenden Arbeiten meist gebrauchten allgemeinen Methoden beschrieben werden. Als Material diente der zerkleinerte, in Phosphat suspendierte Brust- muskel der Taube. Die Tiere wurden durch Dekapitieren getdtet, sogleich aufgespannt, der Brustmuskel mit einem scharfen Messer ausgeschnitten, einige Sekunden auf His gekihlt, dann rasch in der eisgekithlten Latapi- hackmaschine gemahlen. Diese Hackmaschine entspricht im Wesen den gewohnlichen Fleischhackmaschinen, mit dem Unterschied, daB das Gewebe nicht durch einen Wurm, sondern, mit einem Kolben gegen die geldcherte Scheibe angepreBt wird. Hierdurch wird die mechanische Schadigung des Gewebes weitgehend vermindert. Das Messer ist scharf und liegt genau det gelécherten Scheibe an. Der erhaltene Brei besteht aus distinkten Stiickcher des Gewebes. Die Lécher an der Scheibe sind 1,5 mm im Durchmesser. Dic Gewebestiickchen, die wir erhalten, sind aber kleiner, da die rasch rotierende1 15) Warburg, Negelein u. Haas, Biochem. Z. 266, 1 (1933). Uber die Bedeutung der Fumarsiure fiir die tierische Gewebsatmung. 17 Messer das in die Locher dringende Gewebe in rascher Folge abschneiden. Der Durchmesser des gréS8ten Teiles der Stiickchen liegt um 0,3—0,5 mm*). Es ist wohl wichtig, diese Verhalinisse zu betonen, da ein so gemahlener Muskel von manchen Forschern als ein Gewebsbrei aufgefa8t wird, in dem die Zellstruktur vernichtet ist. Dies trifft nicht zu. Der ,,Brei“ besteht aus relativ intakten Gewebsstiickchen und kann mit den Gewebssehnitten ver- glichen werden. Solch ein Gewebasstiick ist eigentlich ein Gewebsschnitt, mit dem Unterschied, da8 der Schnitt nicht in einer, sondern in drei aufeinander senkrechten Ebenen angelegt ist. Werden Leber oder Niere in dieser Weise zerkleinert, so enthalten die einzelnen Stiickchen im Durchschnitt 10000 Zeilen**). - Sollte das Muskelgewebe ,,gewaschen‘‘ werden, so wurde der Brei im 20fachen Volumen destillierten, eisgekiihlten Wassers suspendiert, hier unter sanftem Riihren 10 Minuten lang belassen, durch ein Tuch filtriert und dann ausgepreBt. Je nach Bediirfnis wurde dieses Waschen 1—3mal wiederholt. Zum Zwecke der respirometrischen oder der Thunbergversuche wurde der gemahlene, gewaschene oder ungewaschene Muskel in 2,65/15 Mol. eis- gekihlten Phosphats von py 7 suspendiert. Auf je 10g Gewebe wurden 30 com Pufferlésung gebraucht. Das Mahlen und Suspendieren wurde mig- lichst rasch ausgefiihrt und der Versuch womdglich sogleich vorgenommen, die Suspension sonst bei 0° bewahrt. Zum respirometrischen oder Thunbergversuch wurde von dieser Mus- kelsuspension stets 1,5 ccm (annihernd 0,4 Gewebe entsprechend) ab- pipettiert. Im VersuchsgefaB8 wurde das Volum mit Wasser oder sonstigen Zusdtzen stets auf 4 com aufgefiillt, so daB die Endkonzentration des Phos- phats 1/,, Mol. entsprach. Die respirometrischen Versuche wurden, wo nicht anders hervor- gehoben, in dem mit Seitengefa8 versehenen Barcroftapparat von 45 ml Volum vorgenommen (Fig. 1). Die CO, wurde durch ein mit NaOH befeuch- tetes Filterpapier gebunden, das in einem Becherchen im Halse des Mano- meters an einem Stahldrahtbigel aufgehingt wurde***) (Fig.1). Alle Versuche wurden, bei 37° ausgefiihrt. Hs wurde stets 10 Minuten vorgeschiittelt, dann die Hahne geschlossen und das Manometer alle 10 Minuten abgelesen. Langer als 1 Stunde wurden die Versuche —- abgesehen von Annaus besonderen Experimenten — wegen Ausschlu8 von Autolyse und Mikrobentatigkeit nicht ausgedehnt. *) Das MaB der Stiickchen ist von dem Drucke und von der Geschwindig- keit der Messer abhangig. **) In der Latapimiihle, wie sie in den Handel kommt, hat die gelécherte Scheibe eine konvexe, rohe hintere Oberfliche, die gegen eine zweite konkave Scheibe anliegt. Zwischen beiden Flachen wird der Gewebshrei zermahlen, wodurch ein groBer Teil der Zellen beschadigt wird. In unseren Versuchen wurde diese zweite konkave Scheibe entfernt, so da®8 die Gewebsstiickchen in dem Zustande weiter verwendet wurden, wie sie die gelicherte Scheibe passierten. ***) Die friiher von Ambrus, Bangaund Szent-Gyérgyi [Biochem. Z. 240, 473 (1931)] beschriebene Methode der Adsorption der CO, wurde ver. worfen, da sich das Abtropfen der Lauge nicht ausschlieBen 1a8t. Hoppe-Seyler’s Zeitachrift f. physiol. Chemie. CCXX XVI. 2 18 A. Szent-Gyérgyi, Die Dehydrierungsversuche wurden in den von mir frither modi- fizierten Thunbergréhren vorgenommen. Da es nétig war, grdBere Serien von Versuchen unter vergleichbaren Bedingungen vorzunehmen, wurden je 12 Rébrchen im Sinne der Fig. 2 an ein weites, mit Hahn versehenes Rohr (~ Fig. 1. Fig. 2. angeschmolzen. Diese Anordnung hat den groBen Vorteil, daB sie es gestattet, gréBere Serienversuche unter identischem O,-Druck anzustellen. Der Farb- stoff wurde in die SeitengefaBe cinpipettiert und erst nach Evakuieren dem Gewebsbrei zugegeben. In unserer Arbeit war es dfters von Bedeutung, den der Dehydrierung entgegengesetzten ProzeB, die Hydrierung, zu messen. Zum Messen dieses Vorganges stand bis jetzt keine Apparatur zur Verfiigung. Bei diesem Versuch muB an Stelle von Farbstoff Leukofarbstoff dem Reaktionsgemisch zugesetzt werden. Die Schwierigkeit des Versuches ist die, daB das Ausmessen des Leukofarbstoffes in vacuo vorgenommen werden muB. Wir haben uns folgender, auf Fig. 3 dargestellter Apparatur bedient. Wie bei Fig. 2 wurden 12 Thunbergréhren an ein Hauptrohr angeschmolzen. Fig. 3. Gegeniiber jedem Rohr wurde ein kleines, blind endendes Réhrchen angebracht. Das Volumen dieses Réhrchens war 1,5 ml. Am einen Ende des Hauptrohres befand sich ein etwa 35 ml fassendes Gefa®. In dieses wurde die Farbstoft- lésung eingebracht. Nach erfolgter Evakuierung wurde aus dem Ansatzrohr Natriumhydrosulfitlésung (Na,S,O,) zugelassen, bis der Farbstoff entfarbt war. In einigen Versuchen war es nétig, einen geringen Uberschu8 von Sulfit zu- zugeben, um den Sauerstoff, der aus dem Muskel nicht ganzlich entfernt werden konnte, zu kompensieren. Durch Drehen seines Rezeptakels wurde die Leukofarbstofflésung in das lange zentrale Rohr einlaufen gelassen und fillte die kurzen Rodhrchen. Sein Uberschu8 wurde in das Reservoir zuruckgegossen. Durch entsprechendes Uber die Bedeutung der Fumars&ure fiir die tierische Gewebsatmung. 19 Neigen des Apparates wurde nun die also verteilte Leukofarbstofflésung den Versuchsréhren, in die der Muskelbrei mit sonstigen Zusitzen eingefillt war, zugegossen. Die Farbanderungen konnten nun im Wasserbade beobachtet werden. Nur die Reaktionsréhren werden in das Wasser versenkt. Fir be- sonderes Schiitteln war nicht gesorgt. Ab und zu wurde der ganze Apparat mit der Hand energisch durchgeschiittelt. Ist der Apparat gentigend evakuiert, so sorgt das fortwihrende Kochen der Flissigkeit: fiir das nétige Mischen. Je nach den Umstinden wurden verschiedene Farbstoffe als Redox- Indicatoren verwendet. Sollten Dehydrierungen in Gegenwart von Fumarat nachgewiesen werden, so muBte ein stark positiver Farbstoff verwendet werden, dessen Leukoform die Fumaraaure nicht mehr zu reoxydieren vermag, dessen Ly also um mindestens 100 mV positiver ist als das #, des Succinat-fumarat- systems. Beliebig positiv konnte aber der Farbstoff auch nicht sein, da um 200 mV das Protoplasma stark zu reduzieren beginnt. Am geeignetsten wurde das 1-Naphthol-2-sulfonat-indo-2,6-dichlorphenol gefunden, dessen Hy o nach Gibbs, Cohen und Cannan!*) bei + 119 mV liegt (pu 7). Als Farbstoff von mittlerem H, wurde Methylenblau gebraucht. Als Farb- stoff negativeren Charakters wurde Indigo-Carmin (5,5’-Indigosulfonat) ver- wendet, dessen Hy, nach Sullivan, Cohen und Clark!’) bei — 125 mV liegt (px 7). Als stark negativer Farbstoff wurde das Neutralrot verwendet (Zpyo = — 330)18). Als Co-Ferment diente in allen unseren Versuchen das von Banga?®) und mir beschriebene, als Hg-Salz isolierte und iber Phosphorwolframsaure gereinigte Co-Ferment der Milchsiureoxydation. Die Substanz wird kurz »Co-Dehydrase genannt. Bei allen Versuchen wurden 0,5 mg dieser Sub- stanz verwendet. Das in dieser Arbeit gebrauchte Hydroxyfumarat und Hydroxymaleinat wurde nach der Methode von Wohl und Osterlin hergestellt®°). Es ist recht schwierig, oxymaleinatireies Oxyfumarat oder oxyfumaratfreies Oxymaleinat herzustellen, da sich die Isomeren rasch ineinander umwandeln und eine Gleichgewichtsmischung geben. Die Reinheit kann durch den Schmelzpunkt beurteilt werden (Schmelzpunkt Oxyfumarat nach Wohl und Osterlin 184°, Oxymaleinat 152°). Der Schmelzpunkt der gebrauchten Préparate wird an entsprechender Stelle angegeben. In neutraler Lésung setzen sich beide Substanzen augenblicklich in die Ketoform um, so da8 wir unter ,,Oxalessigsiure’ in vorliegender Arbeit eine frisch zubereitete neutrale Lésung des Gleichgewichtsgemisches von Oxy- fumarat und Oxymaleinat verstehen*). 18) Hyg. Lab. Bull. Washington 151, 159 (1928). 1?) Hyg. Lab. Bull. Washington 151, 78 (1928). 18) K. G. Stern, Tab. biol. 10, 4 (1934). 18) Diese Z. 21%, 39 (1933). 20) Ber. chem. Ges. 34, 1139 (1901). *) Ich bin fir die Herstellung einiger Praparate der I. G. Farben- industrie A.-G., Frankfurt a.M.-Héchst, zum Danke verbunden. Dieselbe Firma hat sich auf meine Bitte hin bereit erklirt, diese Substanz als Labora- toriumspraiparat herzustellen und hiervon auf besonderen Wunsch kleinere Mengen als ,,Enol-oxalessigsiure“ abzugeben. Q* 20 I. Banga, Es war éfters nétig, zwischen Oxalacetat und Pyruvat zu unterscheiden, die beide eine identische Nitroprussidreaktion geben. Dies konnte mit Hilfe von Anilin geschehen, das bekanntlich Oxalacetat, nicht aber Pyruvat zersetzt. Wir lésen 5°, Anilin im 0,2 mol.-pq 5-Acetatpuffer und geben von dieser Lésung gleiche Teile zur zu untersuchenden Flissigkeit. Dann wird 15 Minuten bei 37° bebriitet, mit NaOH alkalisiert, 2mal mit Ather aus- geschiittelt (wodurch das itberschiissige Anjilin entfernt wird). Um Wiederholungen zu vermeiden, sei noch ein Wort tiber die Fumarase gesagt. Wie bekannt, enthalt der Muskel, selbst auch noch im gewaschenen Zustande, eine hochwirksame Fumarase. Wird also Fumarat dem Muskel zugesetzt, so wird, wenn keine ganz besonderen Ma8nahmen getroffen werden, dieses in kiirzester Zeit 2u */, in Apfelsaure umgesetzt und somit der Bestim- mung entzogen. Dasselbe gilt auch fiir das natirlich anwesende Fumarat. Die analytisch gefundenen Fumaratwerte miissen also stets mit 4 multipliziert werden, um die gesamte, in der Oxydationsstufe des Fumarats befindliche Substanz zu ergeben. Diesen Wert, der also dem Vierfachen des analytisch gefundenen Fumarats entspricht, werden wir kurzweg als ,,Fumarat* (Fumarat in Anfihrungszeichen) bezeichnen.