~~ . & Y pie ho bP, ‘ / ~~ “fy oak : ~™ =a, — k joo Oe M DY (2a i Be o : ws i : \ on nes Ueberreicht vom Verfasser. a Abdruck aus der Zeitschrift fir Immunitatsforschung. Bd. 55. 1928. Heft 3/4 herausgegeben von E. Friedbe R. Kraus Sachs P. Uhlenhuth (Berlin- Dahlem) (Wien) (Heidathesp) (Freiburg i. Br.) Verlag von Gustav Fischer in Jena. 324 F. Neufeld und Walter Levinthal, Nachdruck verboten. [Aus dem Institut , Robert Koch“, Berlin.] Beitrage zur Variabilitat der Pneumokokken. Von F. Neufeld und Walter Levinthal. I. Umwandlung virulenter in avirulente Pneumokokken. Unter den Bakterienarten, die angesichts ihrer betrichtlichen Neigung zu Umwandlungen als labile bezeichnet werden kénnen, steht im Vordergrunde als ein dankbares Objekt fiir Variabilitits- studien der Pneumokokkus. Die auBerordentliche Empfindlich- keit des eigentlichen Krankheitserregers, des typspezifischen und virulenten Keimes, macht die unveranderte Erhaltung seiner Eigenschaften im Laboratorium zu einer schwierigeren Aufgabe als die Gewinnung avirulenter Varianten. Dabei erweisen sich diese Umwandlungen in der Richtung zum apathogenen Sapro- phyten, die die amerikanischen Autoren treffend ,,Degradierung“ genannt haben, als Ausdruck irgendwelcher Schadigungen der Keime. Die Verhiitung solcher Degradierungen gelingt einmal durch Konservierung der Bakterien im Zustande der Latenz (in eingetrockneten Organstiicken im Exsikkator oder nach der Me- thode von Ungermann in itberschichtetem Serum) und anderer- seits durch Ausschaltung schidigender Faktoren bei der Ziichtung, durch regelmaBige Weiterimpfung junger Kulturen. . Zu diesem Aweck bewahrte sich uns in bisher nicht mitgeteilten Versuchen ausgezeichnet die kitnstliche Herabsetzung der Wachstumsintensitat durch Ziichtung bei 25°; nach diesem Verfahren gliickte bei zwei- tagiger Ueberimpfung die jahrelange Erhaltung intakter, maximal virulenter Stamme (Levinthal). Wie bekannt, verfiigen wir tiber mehrere Methoden, um die Umwandlung hochvirulenter in véllig avirulente Pneumokokken, die von friiheren Untersuchern oft, aber doch mehr als ein zu- falliger, meist unerwiinschter Befund beobachtet wurde, durch bestimmte Verfahren regelmaBig zu erzielen. Dazu dient vor allem die Ziichtung in Bouillon mit Zusatz von spezifischem Immun- serum: je nach Menge und Starke des zugesetzten Serums treten schon in der ersten oder erst in folgenden Generationen bei tig- ee eto Beitrage zur Variabilitét der Pneumokokken. 325 licher Ueberimpfung neben den virulenten avirulente Formen auf, bis schlieBlich sémtliche Keime in avirulente umgewandelt sind. (Stryker, Griffith, Amoss, Reimann u. a.). Hine zweite Methode zur Gewinnung von avirulenten Formen ist die Ziichtung in Bouillon mit allmahlich steigendem Zusatz von Galle (Amoss, Reimann). Haufig, wenn auch wohl nicht so regelmaBig, gelingt die gleiche Umwandlung durch Ziichtung bei 39° C (Yoshioka). (Literatur s. bei Neufeld und Schnitzer, ,.Pneumokokken“, in Kolle-Wassermann, 3. Aufl.) Auf die Frage, inwieweit auch im infizierten Tier unter dem Hinflu8 von spezifischen Antikérpern eine Umwandlung der Er- reger in schwach oder avirulente Formen erfolgt, wollen wir hier nicht eingehen. Seit den Untersuchungen von Bernhardt und Paneth ist aber bekannt, da8 unter dem Einflu8 normaler Ab- wehrkrafte des Organismus virulente Diphtheriebazillen sich in avirulente verwandeln, und daB dieselbe Umwandlung in vitro durch Einwirkung von Normalserum sich erzielen 148t — Ergeb- nisse, die Levinthal unter Anwendung des Hin-Zell-Kultur- verfahrens bestatigt hat. Offenbar handelt es sich dabei um ein allgemeines Gesetz; so spalten selbst maximal virulente haémolytische Streptokokken im Korper der Maus schon innerhalb der ersten Stunden nach der Infektion schwach virulente, griin- wachsende Streptokokken ab (Morgenroth und Mitarbeiter, Kuezynski und Wolff). Wir haben nun versucht, entsprechende Umwandlungen von Pneumokokken in vitro unter dem Kinflu8 normaler Organe zu erzielen; bei dieser Versuchsanordnung ist der stiérende Faktor des Tierkérpers mit seiner Saprophytenflora ausgeschaltet. Wir kniipften dabei an eine Beobachtung von Richet) an. Richet hat kirzlich mitgeteilt, da8 Organstiicke von Kaninchen oder Meerschweinchen (Leber, Milz, Muskel), wenn sie frisch einer Auf- schwemmung von Tuberkelbazillen in Kochsalzlésung zugesetat wurden, nach etwa 2 Wochen nicht nur eine Abtétung (gepriift im Meerschweinchen), sondern sogar eine teilweise Auflésung (gepriift im Zahlpraparat) herbeifiihrten, waihrend die gekochten Organe eine entsprechende sichere Wirkung vermissen lieBen. —_— rrraL 1) Ch. Richet fils, La bactériolyse tissulaire du baciile de Koch. Compt. rend. société biol., T. 96, 1927, p. 965. 326 F. Neufeld und Walter Levinthal, Auch unsere Versuche an Pneumokokken wurden in Parallel- reihen mit frischen und mit gekochten Organstiicken angesetzt. Gepriift wurden Niere, Herz, Milz und Leber, die unter sterilen Kautelen entbluteten Kaninchen entnommen und nach der Zer- schneidung in Bouillon blutfrei gespilt waren. Die bohnen- bis pflaumenkerngroBen Stiicke wurden entweder sofort in Roéhrechen mit 5,0 com Bouillon beschickt und nach 24stiindiger Sterilitats- priifung am nachsten Tage beimpft, oder vor der gleichen Bearbeitung 8 Tage lang ohne Zusatz der Nahrfliissigkeit im Eisschrank konserviert. In beiden Fallen warde kurz vor der Beimpfung die eine Reihe der mit Bouillon beschickten Organréhrchen 5 Minuten lang im kochenden Wasserbad erhitzt. Als Nahrflissigkeit eignete sich weniger gut die autoklavierte Bouillon, die bei uns aus Pferdefleisch hergestellt wird; die besten Resultate ergab eine einfache, nicht autoklavierte, nur dampftopferhitzte, gepufferte Kalbfleisch- briithe mit Wittepepton px 7,8. Die Einsaat des maximal virulenten Typ I (Stamm Agr.) betrug einmal ¥, Tropfen einer 24stiindigen Pferdeserumbouillon, einmal einen Tropfen einer wenige Stunden bebriiteten, gerade erkennbar getriibten Kultur im gleichen Medium. Simtliche Réhrchen blieben dauernd im Brutschrank und wurden anfangs taglich, spiiter alle 2 Tage, schlieBlich in 8—5Stagigen Abstinden mittels Kapillarpipetten abgeimpft und anf Blutplatten ansgesiit. Die Ergebnisse mehrerer Versuchsreihen, die untereinander nur unbedeutende Differenzen zeigten, lassen sich folgendermaen zusammentfassen. 1) Wahrend die Bouillonkontrollréhrchen ohne Organzusatz nach 2—3—5 Tagen steril und nach einigen weiteren Tagen durch Autolyse villig geklart waren, blieben die Pneumokokken in den Glasern mit den gekochten Organstiicken unerwartet lange am Leben. Nieren-, Milz- und Herzkulturen konnten meist noch nach einem Monat, manchmal nach 14% Monaten mit reicher Kolonie- ausbeute abgeimpit werden. Anders verhielten sich nur die gekochten Leberréhrchen; nach 3—5 Tagen, also gleichzeitig mit den Bouillonkontrollen, erwiesen sie sich als steril; nur einmal blieb eine solche Kultur fast einen Monat lang am Leben. Méglicherweise spielt die Saure- bildung aus dem Glykogen eine unheilvolle Rolle fiir die Bakterien. 2) Im Gegensatz zu den Réhrehen mit gekochten Organen entfalteten die frischen Organstiicke eine charakteristische Wir- kung auf die Pneumokokken. Insbesondere wenn die Organe bald nach ihrer Entnahme aus dem Tierkérper verarbeitet wurden, erwlesen sich die Keime nach wenigen Tagen als abgetétet. Wenn Beitrige zur Variabilitét der Pneumokokken. 327 auch das Absterben oft fast gleichzeitig wie in den Bouillon- kontrollen auftrat, so ist es nicht angingig, deshalb den Organ- zusatz fiir unwirksam zu halten und den friihen Tod der Keime auf die eigenen Stoffwechselprodukte zu beziehen. Aus dem Ver- gleich mit den entsprechenden Kulturen mit gekochten Organen schlieBen wir vielmehr, daB von dem frischen Organstiick eine Schadigung besonderer Art ausgeht, die auf labilen Stoffen beruht. Der schidigende Faktor wird namlich nicht nur durch die Er- hitzung auf 100° fast oder villig ausgeschaltet, sondern auch durch die Konservierung der Organe im Eisschrank deutlich abgeschwacht. Das in der Tabelle dargestellte Beispiel gibt davon ein deutliches Bild. Die Réhrchen mit den 8 Tage auf Eis gehaltenen, nicht gekochten Nierenstiicken iiberlebten 17 resp. 20 Tage, wahrend die entsprechenden Kulturen mit gekochten Organen beide 44 Tage am Leben blieben. 3) Die Wirkung dieses thermolabilen Faktors zeigt ‘sich nun nicht nur in seiner Fahigkeit, die Bakterien abzutéten, sondern kann sich schon frihzeitig in einer Umwandlung der virulenten, typspezifischen Keime zu avirulenten, nicht mehr typspezifischen, also degradierten Varianten auBern. Die taglichen Plattenaus- saaten geben von dieser Variation ein vorziigliches Bild und zeigen die schrittweise Zunahme des Prozesses. So erscheinen beim Be- ginn des Umwandlungsprozesses zwischen den zahlreichen unver- anderten, groBen und feucht glanzenden Kolonien des virulenten Typs nur vereinzelte kleine, trockene Variantenkolonien, die nun von Tag zu Tag zunehmen, um mehr oder weniger rasch die Ueber- hand zu gewinnen und schlieBlich allein titbrig zu bleiben. Abgesehen von Gréfe, Feuchtigkeit und Walbung der” Kolonie ist das charakteristischste Symptom die Beschaffenheit der Oberfliche, die auf Chloro- formblutplatten, aber auch schon auf dem gewohnlichen 5proz. Pferdeblut- mischagar bei mikroskopischer Schragbetrachtung im auffallenden Licht (Ob- jektiv 10mal, Okular 5mal = 50fach) meist tiberaus deutlich wird: virulente Pneumokokken besitzen eine spiegelglatte (smooth) Oberflache, die sogenannte S-Form, degradierte erscheinen kémig zerkliiftet oder rauh (rough) als R-Formen (Arkwright u. v.a.). Stets entspricht diesem Unterschied der Kolonieober- fiche ein verschiedenes Verhalten der Bakterien bei der Verreibung in Wasser und bei der Ziichtung in flissigem Medium: S-Bakterien lassen sich vollig ho- mogen aufschwemmen und wachsen in Bouillon rein diffus (D), R-Bakterien kriimeln bei der Verreibung mehr oder weniger stark und wachsen in Bouillon als Bodensatzhaéutchen von granulierter Beschaffenheit (G) (de Kruif). Tabelle I. F. Neufeld und Walter Levinthal, 328 Aussaat Ungekoeht | Gekocht nach _ Niere | Niere | Milz | Leber | Leber Niere Niere Milz ' Leber | Leber 1. | tag | ++8 +48 448/448] 448 |+48 ++8 | +48 +48 | +48 Woche | 2 Tagen|++S ++8 +4+8! +8] +8 +48 +48 |++8 +8| — 3. | +S #R) +8 +R) +45) — + $ +R j/++8 ++58 |++58 £8] — 5 +48) 45 ¢€R) —- | - +58 +R /++5 ++8 |++8 — 6 oy +4+R)/ 4+ 54+4R) — +S +R [+48 +45)+4+5S 2R — Toy ++R/ +45 4R +R (+45 ++8/++85 1R 2 | 8 » ++R. +R — +48 +4+5 | ++8 Woche | 9, ++R ++R _ +48 ++8|/++8 | 100, | ++R ++R ++8 +48} +48 2, ++R ++R ++8 ++8/448 3, | 16, ++R ++R +458 ++8 }++8 Woche | 17 _,, ++R) ++R ++8 ++8 | ++85 20 4, - | ++8 ++8 ++8 1++8 22» Oo | +48 +48 [448 4. 24 hoo | ++8 ++8 ++8 Woche | 26 __,, | ++8 +4+8/ +585 +R 29s, | | +48 ++8} + S++R 5.8L, | | ++8 +48) +S +4++R Woche | 33 __s,, +48 ++5 ++R 37, ++58 ++8 ++R 6. |40,, | | | ++8 ++8 ++R Woche 4 » | +8 ##8/ +5 +R | ” | i _ —_— — | Organversuch in Pneumokokkenbouillon. Organe vor Verarbeitung 8 Tage auf Eis. Einsaat Pneumokokkus Typ I (Stamm Agr.). S = Spiegelglatte Kolonien des virulenten Stammes. Kolonien einer schwach virulenten Zwischenstufe. 2 = 2 Kolonien, + = wenige Kolonien. R = Rauhe Kolonien der avirulenten Variante. -+ = geringere Mengen von Kolonien. ++ = groBe Mengen von Kolonien. s= Kleinere, glatte Beitrage zur Variabilitéit der Pneumokokken, 329 Agglutination und Virulenzpriifung bestatigen die tief ein- preifende Differenz. Die Tabelle I gibt den erfolgreichsten der Versuche wieder, der in 10 Reihen, 5 gekocht, 5 ungekocht, und zwar mit je 2 Nieren-, je 1 Milz- und je 2 Leberréhrchen angesetzt wurde. Den auffallendsten Unterschied zeigt der Vergleich der ge- kochten und rohen Nierenréhrchen. Charakteristisch aber ist auch der mehrfach beobachtete Gegensatz in der Milzreihe; wihrend das ungekochte Organ nach 5 Tagen ohne Uebergang durch ein Stadium der Umwandlung sterilisiert, treten im gekochten Réhr- chen gegen Ende der 4. Woche mehr und mehr R-Kolonien auf und haben im Laufe der 5. Woche die S-Formen villig verdrangt; erst am Beginn der 7. Woche kiindet dann die starke Verminderung der Aussaat den nahen Tod auch der Variante an. Auch da8 in dieser Reihe am 6. und 7. Tage schon ganz vereinzelt eine R-Kolonie in der dichten S-Aussaat auftaucht, spricht fiir einen besonderen Reichtum dieses Organs an dem sehidigenden Faktor, der durch Kochen also nicht vollstandig zerstért wird. Bemerkenswert erscheint weiterhin ein Befund aus der Reihe des ersten mit gekochter Niere beschickten Réhrchens. In der letzten positiven Aussaat treten neben unveranderten S-Kolonien iiberwiegend etwas kleinere, aber ebenfalls glatte Kolonien (s) auf, deren Bouillonkultur rein diffuses Wachstum zeigt. Wahrend die Agglutination unverindert die des Typ I ist, weist der Tier- versuch auf die beginnende Degradierung hin; der Stamm zeigt im Vergleich mit der unverinderten S-Kultur erheblich verminderte Virulenz, einmal um das 10000fache, ein zweites Mal sogar um das 1000000fache, und hat die Fahigkeit der Kapselbildung auch im septisch itberschwemmten Tierkérper verloren. Mauseversuch intraperitoneal 0,5 com einer 24stiindigen Serumbouillon- kultur, geziichtet bei 25°, verdiinnt mit Bouillon. Variante s. 1. Versuch: £: 10000 f;, Kapsel —. : 1000000 iiberlebt. :100 },, Kapsel —. : 10000 iiberlebt. Typischer Stamm 8. 1: 100000000 +,, Kapsel --. 1:10 Milliarden nicht gepriitt. Zeitschrift fiir _Immunitaétsforschung. Bd. 55. 2. Versuch: HH ee vw bo 330 F. Neufeld und Walter Levinthal, Die erhebliche Herabsetzung der Virulenz in Verbindung mit dem Verlust des Kapselbildungsvermigens trotz der Vermehrung im Tierkérper beweist das mehrfach bestrittene Vorkommen schwach virulenter Zwischenstufen 1). In der Tabelle I sind die avirulenten Varianten als R-Formen msammengefaBt. In der Tat haben sie alle das Merkmal der rauhen Kolonieoberfliche, des G- (granulierten, d. h. Bodensatz-} Wachs- tums in Bouillon, der Avirulenz, der Inagglutinabilitét durch Typ- seren miteinander gemeinsam. Da8 sie dennoch Differenzen unter- einander aufweisen, lieB sich an drei Varianten zeigen, die alle aus der Aussaat der ersten ungekochten Nierenreihe am 3. Tage durch Abimpfung einer einzigen R-Kolonie abgespalten worden waren, und die wir als Ra, Rb, Re bezeichnen. Die drei Abarten zeigten nach TIsolierung in Ein-Zell-Kulturen neben gering- figigen, aber deutlichen kulturellen Unterschieden eine etwas verschiedene Gallelislichkeit; der Stamm a wird in 10proz. Natrium 1) Fiir die Priparate aus den Mauseorganen bewahrt sich die in Deutsch- land zu wenig bekannte Kapselfirbung nach Muir, die etwas modifiziert aus- gezeichnete, kontrastreiche Bilder gibt. Kapselfirbung nach R, Muir. Lésungen: Unverdiinntes Karbolfuchsin nach Ziehl, Léfflers Methylenblan, Spezialbeize. Beize: Gesittigte Lésung von Sublimat ....... 2 Teile 20proz. Lésung von Tannin ......... 2 Teile Gesittigte Lésung von Kalialaun. ..... 5 Teile Der diinne, lufttrockene Ausstrich wird in der Flamme fixiert. 1) Farbung mit dem Karbolfuchsin unter wiederholter leichter Erwar- mung (Dampfbildung) 2 Minuten. 2) Griindliche Spiilung unter dem Wasserstrahl. 3) Beizung 1 Minute. 4) Griindliche Spiilung unter dem Wasserstrahl. Wahrend dieser Wasser- spiilung 1a8¢ man einmal ganz kurz, d. h. 1 Sekunde lang, Methylalkohol tiber das Praparat flieBen. 5) Gegenfirbung mit dem Léfflerblau 1—2 Minuten. Wasserspiilung, Trocknung. Zur Konservierung der Praparate muB das Zedernél jedesmal sorg- faltig entfernt werden, da sonst die Farbung stark abblaft. Die Kokken sind wie dic Zellkerne leuchtend rot, die Kapseln wie das Zellplasma hell blau gefarht. ma soy Beitriige zur Variabilitat der Pneumokokken. 331 taurocholicum bei Zimmertemperatur schnell und komplett, b lang- sam, aber komplett, ¢ sehr langsam und nur unvollstindig gelést, wahrend sich diese Unterschiede bei 37° mehr oder weniger ver- wischen. Vor allem aber verhielten sich die beiden Varianten R a und Rb in den nunmehr zu schildernden Umwandlungsversuchen viollig verschieden. It. Umwandlung von avirulenten in virulente Pneumokokken desselben und eines fremden Typus.’ Die Ein-Zell-Kulturen der beiden degradierten Stimme Ra und Rb, deren Entstehung soeben geschildert wurde, haben wir benutzt, um damit die bedeutsamen Versuche von F. Griffith itber die Umwandlung avirulenter Pneumokokken (R-Formen) in virulente (S-Formen) des gleichen oder auch eines fremden Typus nachzupriifen. Die Mitteilung von Griffith ist soeben im Journal of Hygiene (1928, Vol. 27, p. 113) erschicnen; durch das Entgegen- kommen von Herrn Dr. Griffith, der dem einen von uns ge- legentlich eines Besuches in London im November v. Js. seine Ergebnisse ausfiihrlich mitteilte, wurden wir in den Stand gesetzt, schon vorher mit den Versuchen zu beginnen. Es ist bekannt, da avirulente Pneumokokken mit so weit- gehender Abschwachung, daB nicht nur 0,5—-1 cem frischer Bouillon- kultur, sondern auch der abzentrifugierte Bodensatz von 10 cem und mehr von Mausen ohne Folgen vertragen wird, gelegentlich wieder in die virulente Ausgangsform zuriickschlagen koénnen. Meist wurden die Riickschlige bei Einspritzung gréBerer Kultur- mengen in Mausen beobachtet, und man hat daran gedacht, da8 in solchen Kulturen doch immer mindestens ein hochvirulenter Keim tibrig geblieben sei, soda es sich nicht um eine Riickver- wandlung, sondern um eine Auslese aus einer Mischung mit zahi- reichen avirulenten Keimen handeln wiirde. DaB eine solche Er- klarung zum mindesten nicht fir alle Falle zutrifft, beweist unter anderem die von Levinthal mitgeteilte Beobachtung, wonach ein aus einer einzigen Zelle gewonnener villig avirulenter Pneumo- kokkus in vitro zur vollen Virulenz zuriickschlug. Auch ohne Ein- Zell-Kultur lé8t sich nachweisen, da®B R-Formen von Pneumo- kokken, die aus Passagen eines virulenten Stammes in verdiinntem Immunserum gewonnen waren, sich untereinander durch die Form 22* 332 ¥. Neufeld und Walter Levinthal, der Agglutination, durch das Immunisierungsvermégen und vor allem durch ihre wechselnde Fahigkeit zum Riickschlag in die Ausgangsform unterscheiden kénnen. Hierfiir lefern Versuche von Griffith (S. 123f.), auf die wir hier nicht naher eingehen wollen, interessante Beispiele. Wie andere Autoren, hat auch Griffith gesehen, daB einzelne seiner Varianten, besonders solche, die nur wenige Passagen in Immunserumverdiinnungen durchgemacht hatten, leicht im Mausekirper zuriickschlugen, andere nur selten und noch andere niemals. Am ehesten lieB sich ein Riickschlag erzwingen, wenn groBe Mengen der Kokken und zwar subkutan eingespritat wurden (Bodensatz von 50—100 ccm). Bekanntlich fihrt man den Unterschied zwischen virulenten und avirulenten (degradierten) Pneumokokken nach den grund- legenden Untersuchungen von Avery und seinen Mitarbeitern darauf zuriick, daB nur die ersteren eine spezifische lésliche Sub- stanz (S-Substanz) besitzen, die von den Autoren rein dargestellt und als Polysaccharid erkannt wurde. Jeder Pneumokokken- typus besitzt sein eigenes Kohlehydrat, das vom ho- mologen Serum noch in Verdinnungen von etwal:1 Mill. prazipitiert wird: auf ihm beruht die Virulenz des Kokkus und alle typenspezifischen Reaktionen (Serum- schutz, Agglutination, Prazipitation). Griffith nimmt nun an, daB die degradierten R-Pneumo- kokken zum Teil diese S-Substanz nicht ganz verloren, sondern vielfach noch einen Rest davon behalten haben, der aber unter gewéhnlichen Umstinden nicht geniigt, um sie virulent zu machen. ,,Wird aber ein solcher Stamm in groBer Menge subkutan injiziert, so lést sich die Mehrzahl der Kokken auf und das dabei frei werdende S-Antigen liefert das Material, woraus die iiber- lebenden R-Kokken ihre rudimentire S-Struktur wieder auf- bauen.‘* Offenbar haben aber die partiell degradierten Kokken nur sehr wenig S-Substanz iibrig behalten, und es erschien daher miglich, durch Zugabe abgetiteter virulenter Pneumokokken mehr geeignetes Material zu liefern; dafiir kénnte dann die Menge der lebenden R-Pneumokokken weitgehend reduziert werden, und zwar so weit, da® niemals ein spontaner Riickschlag zu erwarten wire. Das S-Antigen der abgetiteten virulenten Keime soll also dabei als Reiz oder als Futter dienen. Beitrage zur Variabilitit der Pneumokokken. 333 Die von dieser Ueberlegung ausgehenden Versuche von Grif- fith sprechen fir die Richtigkeit seiner Voraussetzungen: es ge- lang ihm vielfach, avirulente I- und [i-Pneumokokken dadurch zum Riickschlag in die virulente Ausgangsform zu bringen, dab er sie in Mengen von 0,25—0,5 cem Bouillonkultur gleichzeitig mit groBen Mengen (Bodensatz von 50—100 cem Bouillon) abge- téteter virulenter Kokken des gleichen Typus subkutan einer Maus einspritzte. Beim Typ [-Pneumokokkus konnte ein Riickschlag auch dann noch erzielt werden, wenn die virulenten Kokken im Dampftopf abgetétet waren, wihrend beim Typus I das abge- titete Material nur dann wirksam war, wenn es 2—3 Stunden auf 60°, gelegentlich auch, wenn es 1 Stunde auf 80° erhitzt war; das Antigen des Typus II erwies sich also als stirker thermo- resistent. Weitere Versuche ergaben nun aber, da8 der Ritckschlag zur Ausgangsform zuweilen auch dann erfolgte, wenn anstatt der homologen heterologe Pheumokokken in abgetétetem Zustande mit- injiziert wurden: so schlugen avirulente R [J-Pneumokokken zu virulenten S []-Pneumokokken zuriick, wenn sie zugleich mit bei 60° abgetiteten virulenten Kokken des Typus I subkutan injiziert wurden. DaB in allen diesen Versuchen das erhitzte Material in der Tat abgetétet war, wurde durch zahl- reiche Kontrollen festgestellt: niemals konnten daraus durch Kultur, auch bei langer Beobachtung, oder dureh Einspritzung groBer Mengen bei Mausen (ohne gleichzeitige Einspritzung lebender avirulenter Kokken) lebensfahige Kokken nachgewiesen werden. Aus diesen Versnchen schlieBt Griffith zuerst, wie schon erwihnt, daB bei der Umwandlung der 8- in die R-Form etwas von dem 8-Antigen iibrig bleibt, und zwar bei verschiedenen R-Stémmen in ver- schiedenem Mae, daB dieses rudimentére Antigen durch die beschriebene Versuchsanordnung bis zur vollen Starke regeneriert werden kann, und ferner da8 ein virulenter Stamm eines Typus neben seinem Hauptantigen eine gewisse Menge von Antigen eines anderen Typus enthalten kann. Wenn die letztere Annahme richtig ist, so ergibt sich daraus die Méglichkeit der Umwandlung eines Typus in den anderen; ja, wenn es gelainge, durch Ziichtung in homologem Immunserum das 334 F. Neufeld und Walter Levinthal, Hauptantigen eines Pneumokokkus auf dieselbe kleine Menge herunterzudriicken, die der Kokkus an heterologem Antigen von Anfang an enthalt (und die durch das Wachstum in seinem zu- gehérigen Immunserum voraussichtlich nicht beeintrachtigt werden wiirde), so miiBte ein derartig degradierter Kokkus ebenso leicht zur Umwandlung in den betreffenden fremden als zum Riick- schlag in den eigenen Typus zu bringen sein. Auch diese Voraussetzung fand Griffith durch das Experi- ment bestiitigt: ein degradierter R [I-Pneumokokkus, der zusammen mit bei 60—70° abgetiéteter virulenter Typ I-Kultur Mausen sub- kutan injiziert wurde, wandelte sich teils in den virulenten Typ I, teils in den virulenten Typ I um. Ferner konnten R I-Pneumo- kokken durch gleichzeitige Einspritzung mit abgetiteten S II- Kokken in virulente IJ-Pneumokokken umgewandelt werden, ebenso eine R-Form der Gruppe IV in virulente Kokken sowohl des Typus I als I, je nachdem abgetétete I- oder II-Kokken xzu- gesetzt werden, und schlieBlich wurden aus R I- wie R I-Stimmen durch Zusatz abgetéteter Typ IIJ-Kokken Mucosusstimme ge- wonnen; hier konnte die Umwandlung, da dem Autor kein spezi- fisches I]I-Serum zu Gebote stand, nicht durch Agglutination bestatigt werden. Es sei bemerkt, da8 die Umwandlung eines Typus in den anderen im allgemeinen nicht so leicht zu erfolgen scheint, wie der Riickschlag in die Ausgangsform des gleichen Typus: daher durfte die Erhitzung bei diesen Versuchen nicht zu weit getrieben werden (nur bis 60° 2 Stunden). In jedem Fall wurde aber auch hier durch zahlreiche Kontrollen die sichere Abtétung festgestellt. Gegen die Annahme, da die virulenten Stémme nicht durch Umwandlung aus dem avirulenten entstanden, sondern aus einzelnen iiberlebenden Keimen des scheinbar abgetiteten Materials hervorgegangen sind, spricht besonders die Beobachtung, da8 auch auf 100° erhitzte Typ II-Kokken den Riickschlag avirulenter I-Pneumokokken zu virulenten hervorbringen kénnen. Versuche, die Griffith unternahm, die gleiche Umwandlung durch Ziichtung mit typenspezifischem Material in vitro zu er- zeugen, sind ausnahmslos vergeblich gewesen. Eine einstweilen kleine Reihe eigener Versuche hat die be- merkenswerten Ergebnisse des englischen Autors bestitigt. Es hat sich gezeigt, daB die sichersten Resultate unter genauer Einhaltung Beitrage zur Variabilitét der Pneamokokken. 335 seiner Methodik zu erzielen sind. Insbesondere scheint die Ver- wendung ganz junger S-Kulturen als ,,Futter“ fiir die R-Staémme von entscheidender Bedeutung zu sein. So hat uns die Benutzung 24stiindiger Brutschrankkulturen zur Herstellung. der abgetoteten Suspensionen nur ganz vereinzelt ein positives Resultat ergeben, und zwar nur bei Verwendung von einfacher, nicht von Serum- bouillon. Es wird zu priifen sein, ob die 24stiindige Ziichtung bei 25° mit verminderter Vermehrungsintensitét nicht bessere Er- gebnisse zeitigt. Der entscheidende Versuch wurde unter strikter Innehaltung der Griffithschen Vorschriften folgendermafen angestellt. 2 Erlenmeyerkolben zu 300 com mit vorgewarmter 2proz. Dextrosebouillon wurden mit je 3,0 ccm einer 24stiindigen Kultur in Serumbouillon (25°) des Pneumokokkus IT (Stamm Erfurt), bezeichnet 8 II, beimpft und nach 5 Stunden Bebriitung bei 37°, deutlich, aber schwach getriibt, verarbeitet. Ein gleicher Kolben, entsprechend beimpft mit dem Stamm Agr. (Typ J), bezeichnet § J, wurde gleichzeitig und in genau entsprechender Weise behandelt. Die jungen Kulturen wurden in einer groBen Zentrifuge 114 Stunden lang scharf ausge- schleudert und nach Abpipettieren der tiberstehenden klaren Kulturflissigkeit so weit eingeengt, daB 0,6 cem von 8 IT etwa 60 com Originalkultur, 0,8 com von SI etwa 60 com Originalkultur entsprach. Die beiden auf erordentlich stark getriibten Aufschwemmungen wurden in Reagenzglisern eingeschmolzen und in ein Wasserbad von 60° versenkt, in dem sie unter mehrfachem Schiitteln 40 Minuten belassen wurden. Nach Oeffnen der Glaser Verteilung zu 0,6 bzw. 0,8 com in kleine Standglischen und Zufiigung von je 0,5 ccm Rinderserum zu jedem Glas. 37° tiber Nacht. Am nachsten Tage wurden von jedem Glaschen 0,1 cem in Serumbouillon sowie 2 Tropfen auf Blutplatten ausgesit, die Bouillon- réhrchen nach 24stiindiger Bebriitung noch einmal auf Platten verimpft. Alle Glaschen erwiesen sich als steril, ein Resultat, das in anderen Versuchsreihen auch schon nach 20 Minuten langer Erhitzung auf 60° regelmaBig gewonnen wurde. Die lebenden Ra- und R b-Kulturen in Serumbouillon (25° 24 Stunden), die wie stets reines Bodensatzwachstum aufwiesen, wurden nach Entfernung der Halfte der iiberstehenden klaren Fliissigkeit aufgeschiittelt und in der Dosis von 0,2 com verwandt; diese Dosis wird stets der abgetéteten, wie beschrieben, mit Rinderserum versetzten und bebriiteten S-Aufschwemmung zugefiigt und gemeinsam einer Maus subkutan am linken Hypochondrium injiziert. Das Resultat des Versuches zeigt Tabelle I. Kontrollen von je 2 Mausen, die 0,2 com der R-Kulturen allein erhielten und tiberlebten, sind fortgelassen. Die gestorbenen (+ mit Ziffer des Todestages) oder getéteten (7 mit Ziffer des Tétungstages) Mause wurden sorgfiltig seziert, Kapselpriparate und Aussaaten auf Blutplatten von der Injektionsstelle (= Lok.) der Bauchhohle (= Per.), dem Herzblut (= Cor.) gemacht. 336 F. Neufeld und Walter Levinthal, Tabelle I. 6 Mause | 2 Mause 2 Manse SII abgetitel + Ra lebend ‘SIL abgetitet +'S II abgetitet allein Rb lebend 3 ts 2 +4 steril lo # Lok. Per. Cor. | ‘1 steril Kapsel + + + | 1 Pneum. —, aus Kultur ++ SM 4+ SIF ++S0 Cor 3 Kolon. u. R Streptoc. virid. 1 todkrank 7, Lok. Per. Cor. Kapsel + ; + + Kultur ++ SU ++ SI ++ SII u. 1 +, Lok. Per. Cor. Kultur Pneum.+, 1 Kol. ST — tiberwueh. Proteus i 1 fs steril ; 2 Mause 1 Maus , 2 Mause SI abgetitet - Ra lebend (SI abgetitee +: SI abgetitet allein Rb lebend 1 te +, steril 2 is . ster Kapsel Tok: Per. Gor, 1 Cor. steal Lok. - u. Per. Sapro- Kultur +R +4R +R \ phyten 1 ts Lok. Per. Cor. Kapsel + + + Kultur +-+reinSI ++SI +451, + = gestorben, * = getdtet, Index = Tag des Todes resp. der Totung, SI = virulente Pneumokokken vom Typ I, S1I = virulente Pneumokokken yom Typ II, Ra und b sind avirulente Varianten des Typ I. Von 6 Mausen, die SII abgetitet, zusammen mit der aviru- lenten Variante Ra lebend erhalten haben, ist also in 5 Tieren die Umwandlung eines degradierten J-Stammes in den virulenten Typ II gelungen. 4 Mause, die mit der gleichen Dosis desselben $ I[-Antigens injiziert worden waren, in 2 Fallen zusammen mit der Variante Rb, in 2 Fallen allein, sind viéllig negativ ge- blieben. Beitrége zur Variabilitét der Pneumokokken. 337 In der kleinen Reihe, die mit dem abgetéteten Material S I behandelt worden ist, starb von den 2 mit Ra kombiniert ge- spritzten Tieren 1 vorzeitig mit einem reinen R-Befund, dessen reiche Ausbeute aus der Peritonealaussaat bei sparlichem Gehalt von Injektionsstelle und Herzblut einen Fehler bei der Einspritzung und eine Begiinstigung des Wachstums der einverleibten R-Kokken durch die in die verletzte Bauchhéhle gelangte S I-Substanz ver- muten la8t. Es sei daran erinnert, da8 abgetétete Pneumokokken des Typus I (nicht solehe des Typus II nach Schiemann und Casper) bei intraperitonealer Einspritzung schon in kleineren Mengen, als sie hier verwendet wurden, Mause titen (Yoshioka). Bemerkenswert ist, da das Ergebnis der Plattenaussaat auf Grund des Kapselpraparates vorausgesagt werden konnte. In der zweiten Maus gliickte die Riickwandlung in den SI-Typ, wahrend die 3 Mause, bei denen das abgetitete SI-Sediment nicht mit dem Stamm Ra kombiniert worden ist, negativ blieben. Der Gedanke, daB die typenspezifischen Pneumokokken nicht aus dem avirulenten Stamm Ra durch Umwandlung resp. Re- version entstanden seien, sondern dem nicht villig abgetiteten S-Sediment entstammen, scheint uns, abgesehen von dem nega- tiven Ausfall aller Kultur- und Tierversuche mit dem erhitzten Material allein in unseren (ebenso wie in Griffiths) Versuchen, besonders auch durch die Parallelreihen mit dem Stamm Rb widerlegt, die niemals auch nur einen verdachtigen Befund dar- geboten haben, ebensowenig wie in anderen hier nicht zu be- sprechenden Versuchsreihen die kombinierte Einspritzung mit Colibazillen. An sich ware es denkbar, da8 durch Erhitzen weitgehend ge- schadigte Pneumokokken zwar nicht durch Bebriitung in vitro, aber doch durch Einspritzung in ein empfingliches Tier wieder zum Wachsen zu bringen sind. Analoge Beobachtungen sind ge- legentlich bei Desinfektionsversuchen nicht nur mit chemischen Mitteln, sondern auch mit Erhitzen gemacht worden. In manchen Fallen sind sie wohl einfach dadureh zu erklaren, da fiir die be- treffenden Bakterien unsere Nahrbéden nicht optimal sind; dies dirfte fiir die Pestbazillen zutreffen, bei denen mehrfach Impt- stoffe, die durch schonende Abtétung hergestellt waren, bei Aus- saat auf Nahrbéden steril erschienen, wahrend sie im Tierversuch 338 F. Neufeld und Walter Levinthal, noch infektids waren. Dagegen hat B. Lange*) gelegentlich auch bei Verwendung optimaler Nahrbéden weitgehend geschddigte Bakterien nicht durch Kulturversuch, sondern nur durch den Tierversuch noch als lebend nachweisen kiénnen, wihrend 6fter das Gegenteil der Fall war. In den vorliegenden Versuchen, sowohl in denen von Griffith wie den unserigen, sind aber auch die Tier- versuche ausnahmslos negativ ausgefallen, und zwar auch dann, wie schon hervorgehoben, wenn gleichzeitig lebende Colibazillen oder auch eine R-Variante von Pneumokokken mitinjiziert wurde, die offenbar zu weit degradiert war, um noch zur Ausbildung, sei es der eigenen verloren gegangenen oder einer fremden S-Substanz, fahig zu sein. Fiir die Hypothese, daf scheinbar abgetiétete Pneumo- kokken nur dann wieder zum Leben erwachen konnen, wenn sie zusammen mit lebenden und avirulenten, aber nicht allzu weit degradierten Kokken eines fremden Typus einem empfanglichen Tier injiziert werden, fir eine solche Annahme fehlt uns jede Analogie. Vielmehr zwingt das immer wieder bestitigte Resultat zu dem SchluB, daB die Umziichtung zum virulenten Typ an eine be- sondere Zustandsform der avirulenten Variante ge- bunden ist. Diese Zustandsform reicht zwar nicht mehr fir einen spontanen Riickschlag aus, wie zahlreiche Kontrollversuche gezeigt haben, befihigt aber den Stamm, aus dargereichter spezi- fischer S-Substanz im Tierkérper Material zum Aufbau des je- weiligen Types zu entnehmen, eine Eigenschaft, die andere Varianten der gleichen Herkunft anscheinend endgiiltig verloren haben. Fir die von Griffith gegebene Erklirung der Umwand- lung haben wir eine sehr naheliegende Analogie, nimlich die Beob- achtungen tiber Paragglutination. Auch hier sehen wir Bakterien die spezifischen Eigenschaften fremder Bakterien — und zwar in diesem Falle von Bakterien einer anderen Art — annehmen. Kuhn und Woithe, denen wir die Entdeckung dieses merk- wirdigen Phinomens verdanken, ziichteten aus dem Darm von chronisch Ruhbrkranken Colistimme, bisweilen aber auch Kokken, die manchmal nur in geringem Grade, vielfach aber auch bis zur —— eo 1) Bruno Lange und K. H. Keschischian, Beitrage zur Methodik der Desinfektionsmittelpriifung. II. Mitteilung. Zeitschr. f. Hyg., Bd. 101, 1923, 8. 88. ‘Beitrige zur Variabilitit der Pneumokokken. 339 Titergrenze mit Ruhrseren agglutinierten und ihrerseits in vor- behandelten Tieren die Bildung von Ruhragglutininen anregten. Ornstein ziichtete im Felde in ruhrverseuchtem Milieu aus Stuhl und Blut vielfach nicht nur Coli-, sondern auch Typhusstimme, die mit Flexnerruhrserum Paragglutination zeigten, und von anderen Beobachtern liegen zahlreiche ahnliche. Befunde vor. Auch in vitro ist es in einer Reihe von Fallen [Literatur siehe bei Papamarku?)] gelungen, Colibazillen eine Paragglutination fiir fremde Arten anzuziichten, indem man sie in Nahrbéden wachsen lieB, die Leibesbestandteile der betreffenden Arten enthielten. Wenn von den zahlreichen derartigen Versuchen, die in ver- schiedener Richtung variiert wurden, nur verhaltnismaBig wenige zu dem gewiinschten Erfolge fiihrten, so ist das im Lichte der durch Griffith neu gewonnenen Erkenntnisse viel- leicht zum Teil darauf zuriickzufiihren, daB nur Bakterienstamme, die sich in einem ganz bestimmten intermediaren Zustande be- finden, zu solchen Umwandlungen geeignet sind, vielleicht nur dann, wenn ibr eigenes Hauptantigen weitgehend zuriickgedrangt und andererseits eine gewisse Anlage zur Ausbildung eines fremden Antigens vorhanden ist. Jedenfalls diirfte es geboten sein, von diesen Gesichtspunkten aus die Versuche zur kimstlichen Erzeugung paragglutinierender Bakterien wieder aufzunehmen. Ob die ,,Auffiitterung’: geeigneter avirulenter Varianten zu virulenten Typen auch mit S-Substanz, die durch Extraktion gewonnen ist, oder durch die typspezifisch mit Pneumokokkus II verwandte Varietat E von Friedlanderbazillen?), die uns bisher nicht zur Verfiigung stand, zu gewinnen ist, muB weiterem Studium vorbehalten bleiben. Einige solcher Versuche, die abge- téteten S-Kokken durch gallegeliste Pneumokokken oder durch ein daraus von Herrn Prof. Schiemann hergestelltes Extrakt zu ersetzen, das reichlich das typenspezifische Kohlehydrat ent- hielt, sind bei uns bis jetzt negativ geblieben. 1) Papamarku, Beitrag zur Frage der Weil-Felixschen Reaktion und der Paragglutination. Zeitschr. f. Hyg., Bd. 87, 1918, S. 469. 2) Arbeiten von Avery, Heidelberger und Goebel, The soluble specific substance of a strain of Friedlinders bacillus. Journ. exp. Med., Vol. 42, 1925, p. 701 u. 709 u. 727. 340 Neufeld u. Levinthal, Beitr. zur Variabilitét der Pneumokokken. Die zum Autbau von S notige Substanz ist anscheinend nicht vllig identisch mit dem typenspezifischen Antigen, das nach zahl- reichen Versuchen auch dureh langes Erhitzen auf 100° nicht wesentlich geschidigt wird. Vielleicht ist eine Vorstufe des spezi- fischen Kohlehydrates oder ein an Proteinstoffe gebundenes Kohle- hydrat notwendig. Auch Griffith sagt bei der Erklarung seiner Beobachtungen, da er unter der zum Aufbau nétigen S-Substanz , die spezifische Proteinstruktur des virulenten Pneumokokkus ver- steht, die ihn befahigt, ein spezifisches lésliches Kohlehydrat herzustellen”. Zusammenfassung. 1) In Bouillonréhrchen mit Zusatz von Kaninchenniere und -leber, die dauernd bei 37° gehalten wurden, trat vom 3. Tage an eine Umwandlung einges&ter virulenter Typ 1-Pneumokokken in avirulente (R-)Formen ein, ebenso, wenn auch verzégerter, in einem Réhrchen mit Zusatz gekochter Milz, wihrend die Kontroll- kulturen in einfacher Bouillon in 2—3 Tagen abstarben und autolysierten, ohne daB dabei Umwandlungen beobachtet wurden. In Rohrchen mit Zusatz gekochter Niere blieben die Pneumo- kokken bis zur 6. Woche lebend und unverindert; nur einmal trat nach der 6. Woche eine in kleinen, aber glatten Kolonien wachsende Zwischenform auf, mit stark verminderter Virulenz und ohne Kapselbildung in der septisch tiberschwemmten Maus. 2) In Bestatigung der neuen Versuche von Griffith gelang es, eine vom Typus I gewonnene avirulente R-Variante durch subkutane Einspritzung zusammen mit abgetiteten S-Kokken im typische virulente Pneumokokken umzuwandeln, und zwar durch Zusatz abgetéteter Typ D-Kokken in II-Pneumokokken, durch Zusatz abgetiéteter Typ I-Kokken in I-Pneumokokken. Bei einer anderen R-Variante der gleichen Herkunft wurde bei derselben Versuchsanordnung eine Umwandlung nicht beobachtet.